サザンブロットのプローブを作るんですが

質問

(1)どのように作ればよろしいんでしょうか？
(2)5'側のプローブと3'側のプローブはどちらも必要なんでしょうか？

凄い基礎的な質問をしてしまい申し訳ないと思うのですが、私が所属する研究室でサザンをやっている人がいないことや指導担当の先輩・技官さんがいないので質問させていただきました。

回答宜しくお願いします。

回答No.2

CTAB · ベストアンサー

１の答えですが、一般的にサザンのプローブはFISHなどと異なり、業者に発注するのではなく、PCR産物を用います。PCR産物をプローブに用いるので、当然なにかしらの修飾が必要ですが、この方法は色々あります。特定配列（70-200bp、300とかでも多分いける。定量PCRのPCRをそのまま流用すると楽）のPCRを行い、そのPCRの際に標識されたdNTPを用いることで、PCR産物に蛍光修飾するやりかたや、PCR産物を後処理してらべりんぐするやり方があります。（1の方の参考URLは後者ですね。使っているのはクローニングしたプラスミドですが）

というわけで、2の答えですが、たぶんセンス鎖とアンチセンス鎖に結合するものの2種類を作らなければいけないのか、という質問だと思うのですが、両方使うことになりますね。二本鎖を泳動して、メンブレンに移すので、片側のプローブどちらかだけでも理論上は大丈夫ですが、プロトコル的に両方のプローブを使うことになります。

お礼

回答ありがとうございます。
両方のプローブが必要なんですか。
んー、面倒な実験ですね。
とりあえず自分が行うサザンのプローブ作りでは、マウスのゲノムから特定の遺伝子配列をＦ、Ｒプライマーで増幅して、その増幅産物をＤＩＧまたはＲＩ修飾されたdNTPをもちいて作製するとのことです。

頑張ってみようと思います。
回答ありがとうございました！

補足

再回答いただけますととても助かります。

私が実施している卒業研究では、マウスの遺伝子解析（サザン＆PCR）をして、条件に合ったものを交配にかけ目的のマウスを作り出すことにあります。

PCRでは目的の遺伝子領域を確認できたのですが、それだけでは遺伝子の解析としては不十分ということで、サザンをやることになり、以前質問をしました。

それで新たに質問なんですが、
ゲノムサザンではRIのほうが効率がいいのでしょうか？
うちの研究室ではRIを推奨しているのですが、東京大学の核内情報研究分野ではDIGでやっても結果は大差ないとおっしゃっています。

どうなんでしょうか？
CTABさんの経験的にはどちらがいいと思われますか？
わたしは安全性の面などからDIGを使用したいのですが、RIをすすめられているので何とも言えない状況になっています。

またサザンのプローブの作成についてですが、
私の考えでは5'、3'側の両方のプローブを作成するためにゲノムから直接、5'、3'のプローブ領域とする遺伝子配列の外側をそれぞれ特異的なプライマーを設計し、それでPCRを行うことで目的とする遺伝子領域の断片（プローブ領域）を作成しました。

自分が設計したプライマーでの増幅はうまく成功し、ゲル抽出をして、次にシークエンス解析を行うことで正しく増幅されたかどうかを確認しようとしています（2009/1/23現在）。

この方法で作成した断片をプローブにしようと思うのですが、この遺伝断片をRI修飾、またはDIG標識をするのはどのように実施するのでしょうか？

DIGではPCRの際に化学修飾された塩基をPCR反応溶液に混ぜ合わせることでPCRが終了した時点でプローブができると思われます。

しかしながらRIではそんなことができるとは思えません。
どのようにやるかどうかも教えてもらえず困惑しています。

頼れるのは自分だけという状況であり、なぜ卒業研究でまともな指導の一つも受けられないのかがわかりませんが。。。

何度も基礎的な質問をしてすいません。
実際に研究室でサザンをやっている人がいないので頼れる人がいないので質問させていただいてます。
回答よろしくお願いいたします。

回答No.1

owata-www

(1)はともかく(2)の意味が分からないので、とりあえず丸投げします

http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b3.html