PCR

質問

２本のプライマーで目的遺伝子をPCRしました．
その後，得られたPCR産物のsequenceを確認したら，２本のプライマー間のsequenceには変異や塩基の欠落等はなかったのですが，それぞれのプライマーの部分に塩基の欠落がかなり見られました．
プライマー間に変異があったとしたなら，間違って塩基を取り込んでしまったのだろうと考えられるのですが，プライマーの部分は購入したまんまの状態なので，業者のプライマー合成ミスということなのでしょうか？
当然プライマーの部分のsequenceがあっているものもありましたので，恐らく購入したプライマーは目的の１種類の配列だけではなくて，間違った配列のものも含まれていると考えられるのでしょうか？
または違った理由で，この様なことが起こるのでしょうか？

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

多分、合成エラーを含むオリゴDNA分子が少なからず混じっていたのでしょう。
合成装置は１ステップで１塩基だけ確実に付加されるように設計はされていますが、例えば試薬がへたっていて反応性が落ちていると、起こるべき脱保護や重合をミスすることも考えられます。
合成受託会社の品質管理のサービスとして、HPLCやPAGEによる分析結果をつけてくるところがありますね。あれは、一つには、合成エラーによる塩基の過不足を起こしている分子が混じっていないかどうかを調べるためのものです。

どこの業者か知りませんが、品質管理が十分でないのかもしれません。その結果を、フィードバックして対策を求めた方がいいですよ。今回はエラーがあってもたまたま増えたからいいようなものの、場合によっていは増えなかったり、増えたとしてもフレームシフトを起こしていたり、複数の波形がかぶってダイレクトシークエンスができなかったりという問題を起こしかねません。対応に誠実さが見られない場合は、他社に乗り換えることも考えておいた方がいいです。

お礼

いつもありがとうございます．
やっぱりプライマーがおかしいのですよね．

回答No.3

AUGQX-MAN

私も塩基配列のシーケンス実験の経験があるのですが、ＰＣＲ産物をシーケンスした時はプライマーの部分（最初の部分と最後の部分）は波が混雑していて、はっきりと出ない場合があります（特に最初の部分が）。
逆方向のプライマーでシークエンスしてパソコンで配列を変換すれば、最初のはっきりしない部分の配列は解明できると思います。

回答No.2

walkinoctopus

合成ミスの可能性も考えられると思うのですが，
（１）sequenceはdirectに読んだのでしょうか？あるいはクローニング→ベクターのsequence primerを使用してシークエンスなのでしょうか？
（２）プライマーは常に欠失なのでしょうか？あるいは本来あるべき塩基とは異なる塩基が入っているのでしょうか？
（３）変異が見られる領域内のシークエンスシグナルの波長はきれいなのでしょうか（立体構造で読みにくい領域であるかどうか）？

補足

（１）クローニング→ベクターのsequence primerを使用してシークエンスを読みました．

（２）今のところ，欠失か余分に付いているかの２通りです．まだ変異はありません．

（３）波長はきれいなところで見ています．またforward，reverse両方から見ています．