プライマー設計におけるヌクレオチド付加

質問

プライマーを設計しようと考えていますが、あるペプチド配列にAlwN Iという制限酵素サイトをつけます。その時に１～６残基程度のヌクレオチドを付加しないと制限酵素で切断効率がおちてしまう可能性があります。このヌクレオチド付加をどのように設定したらよろしいでしょうか？バイオラボのカタログにもこの制限酵素は載っておりませんでした。　お願いします。

回答No.2

Chicago243

よく切れる酵素では4ベースほど延長しますGとCを使います。GCGCとかCGCGとかですね。

私がよくやるのは、テンプレートに制限酵素の認識配列とよく似た配列が取り出そうといている末端にないか探します。6塩基中5塩基とか場合には4塩基くらいあっていればそこを真ん中にプライマーを設定します。プライマーは長めに設定しますが(28mer以上)100%あってなくてもプライマーとして機能しますのでそれでPCRをするわけです。もしそういう配列が見つからない場合は末端を延長しますが、、、
PCRプロダクトの末端は制限酵素で切れにくいですので、もしPCRプロダクトがうまく目的のプラスミドにはいらないようでしたら、以下の事をお試しください。PCRプロダクトがの末端が平滑である場合は末端をりん酸化して、それからライげーションしてください。そうするとコンカテマーというPCR断片がつながったDNAができます。その後酵素で切ります。末端が平滑でないばあい(TAQポリメラーゼを使った場合)は平滑化が必要です。

あとはパズルみたいなものなので、いろいろ工夫ができるとおもいます。

AlwNIの認識配列がCAGNNNCTGなので、まったんがCAGNNN(CAGCCGとか)のプライマーを作っておいて、クローニングベクターのPvuII(CAG/CTG)サイトに平滑で挿入するとできたプラスミドとインサートの末端でAlwNIサイトができます。もう一方の末端をEcoRIのような扱いやすいものを使えば片方が平滑でも簡単に入れることができると思います。できたプラスミドをAlwNI cutすればいいわけです。

この手のサブクローニングはうまく行くはずでもそうでなかったりすることがたまにあるので複数のストラテジーをもってなるべく並行してやる方が解決が早いと思います。

参考URL：

http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0514.asp

回答No.1

hypertensive

AlwNIはNEBにはあるようです．

"制限酵素の基礎知識"を見てみると，６塩基以上付加したほうが無難ということです．

その付加する配列ですが，こうしなければならない，というものではなく，注意点さえ守れば（増幅効率に差が出るかもしれませんが）PCRはかかると思います．

１．3'末端と相補的ではいけません．あと，他方のプライマーとも相補的でないこと．プライマーどうしのダイマーができる可能性があります．

２．付加した配列が他の場所にない方がよいとは思いますが，5'末端なのでこだわる必要はありません．

３．プライマー全体のTm値が高すぎないようにすること．特に6塩基とかくっつける場合，GとかCばっかりにすると結構高くなっちゃうことがあります．他方のプライマーとの相性ですね．

以上が私が気をつけていることです．

ちなみにAlwNIはDcmメチル化されるので，普通の大腸菌に入れるときはcagnnCctgG（大文字のところを注意）でないことを確認してください．

お礼

大変ご丁寧にありがとうございました！
大変参考になりました。
がんばってプライマーを設計してみます。