ダイデオキシ法におけるプライマー配列について

質問

ダイデオキシ法におけるプライマー配列の設計は、フォアードプライマーは、目的の配列の3'→5'の前方に結合するように、リバースは相補鎖の5'→3'の向きで結合するように設計しますが、疑問があります。

(1)ダイデオキシ法は、普通のPCR（設計したプライマーで、はさまれた間が増幅される）と異なり、元のDNA鎖に何度もプライマーが結合し、その後にddNTPが結合して順番に塩基が読めるものと理解していて、出来上がった遺伝子断片に再び、プライマーが結合することはなく、もとのDNA鎖のみに何度も結合していくのですよね？この理解は正しいのでしょうか？

(2)読めた配列のデーターに、プライマーの配列も読めるのでしょうか？
プライマー以降にddNTPが結合していくので、プライマー自体は配列が読めない気がします。しかし、出来上がったプライマー＋目的の配列を持ったDNA鎖に相補的にまたddNTPが結合すると、プライマーを含めた目的の配列が読める気がします。プライマーがなくてもddNTPは相補的な配列をもったDNA鎖に結合することができるのでしょうか？プライマーが結合し、そこからポリメラーゼが来て、dNTPを使って伸長反応をするので、プライマーがなくてもddNTPが結合して配列が読めるというのは間違っていますよね？設計したフォアードの配列がシークエンス結果の配列にあってなぜ読めるのか不思議になりました。

(3)伸長反応は酵素にもよりますが、全長は伸びず途中までしか読めないことから、シークエンス解析では、フォワードとリバースをプライマーに用意しますが、疑問があります。リバースを用いて読めた配列を反転し、フォワードを用いて読めた配列と結合するのは、機械が自動的にしてくれるのでしょうか？

頭がこんがらがってしまい、困っています。どなたかよろしくお願いします。

回答No.1

CTAB

１；あっています。アニーリング（鋳型にプライマーがくっつく）＞伸長＞熱変性。を繰り返すだけです。増幅断片はその後の増幅されませんし、増幅に利用もされません。

２；読めません。相補鎖的な配列にくっつくためのプライマーを添加しないので、増幅しないためです。ですので、質問にありますが、プライマーがなくてはdNTPは結合しません。〈あとddNTPは終末端です。伸長するときに結合するのはdNTP）
設計したフォワードがはいってたというのはよくわかりませんね。クローニングとかしてませんよね？　シーケンスに使ったプライマーが読めてるのはおかしいです。理論的にはありえません。プライマー配列のタンデムリピートとか、実験ミスとかを再確認してください。

３：これは機械によります。でも普通はしてくれません。自分でアライメントしてください。あと長塩基を解析できない理由は、全長は伸びず・・・というよりは100と101は区別できても10000と10001の区別は難しいから・・・という電気泳動的な問題です。

お礼

お礼が遅くなりすみませんでした。
ご丁寧にありがとうございました。よく分かりました。