プライマー

質問

NESTEDまで行うPCRのプライマーを設計したのですが、実際行ってみると、NESTEDまでPCRを行ったものはくっきりとバンドが出でいたのですが、ファーストPCRを行っただけのPCR産物の方にはバンドがほんとにごくわずかしかでていません
やり直した３回とも同じ結果です
以前ほかのものを行った時も、ほとんどバンドが出ないプライマーのセットがありました

きちんと作成して、存在するはずの塩基配列のプライマーなのに、このようにPCRで増幅しにくいものがあるのはどうしてでしょうか

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

DNAはタンパク質ほど残基の違いによって性質が変わるわけではありませんが、
それでも配列によって違う構造をとったりします。

増やしたいの配列がGC-richだったり、
インバーテッドリピートなどの高次構造をとりやすいものだと
伸長反応が止まってしまい、
増えにくくなる場合があります。

バッファーやDNAポリメラーゼを替えたり、
7-deaza dGTPを使うことによって
改善する場合があります。

補足

回答ありがとうございます

なるほど、そういう理由がかんがえられるのですね
大変参考になりました

＞増やしたいの配列がGC-richだったり、
インバーテッドリピートなどの高次構造をとりやすいものだと・・・

NESTEDプライマーではきちんとPCRプロダクトが産生されているので大丈夫だと思うんですが。。。
プライマーはすべて２０塩基で、GC含量が、11～12個（50～60％）になるように設計してます

＞バッファーやDNAポリメラーゼを替えたり、
7-deaza dGTPを使うことによって
改善する

私の研究室には残念ながら備えがありません

また新しくプライマーを設計しなおしたほうがよさそうですね
なかなか難しいです
ありがとうございました