癌遺伝子SRCリン酸化について

質問

ヒトの癌細胞を使って、癌遺伝子SRC(60kDa)リン酸化の発現をウェスタンブロティングで解析しています。
SRC抗体を用いても、リン酸化SRC抗体を用いてもどちらも60kDaのところにきれいにバンドが出ているのですが、リン酸化抗体の方には120kDaのあたりにもバンドが出ているものがあります。
ダイマーを形成しているのかな？と考えたのですが、その場合、SRC抗体を用いたものにも120kDaにバンドが出るような気がします。
リン酸化を起こすときにダイマーを形成することがあるのでしょうか。
120kDaのバンドは非特異的なものと解釈してよいのでしょうか。
今後、このように進めるとよい等があれば教えていただきたいと思います。
よろしくお願いいたします。

回答No.1

tatoo

まず、Srcのダイマーの形成についてですが、私は聞いたことがありません。形成しないと思います。
と、その前に、Srcが60kDaのあたりに検出されているとのことから、変性条件下のSDS－PAGE後にウエスタンをやられたと思います（Native PAGEではなく）。
その変性条件下でもダイマーを維持したまま泳動されるには
共有結合など、相当強い結合であると考えられますが、どう思われますか？
私はだったらその意味で、ダイマーの可能性は考えません。

リン酸化Srcの抗体は何を使われたかわかりませんが、経験上、リン酸化したものを認識する抗体はけっこう非特異的なバンドが検出されることが多いです。

細胞の中には、ものすごく多くのリン酸化タンパク質が存在しますので。。。

お礼

専門家のご意見、ありがとうございました。
Srcの専門家、生化学の専門家がすぐ近くにいないもので質問させていただきました。
Srcダイマーは形成しないと思われるということ、また変性条件下のSDS-PAGE後のウェスタンということを考えるとご指摘していただいたように考えるのが妥当だと思います。
僕が使用したリン酸化Src抗体は論文にもなっている抗体(C-S社)です。
確かに他にもリン酸化抗体を使用していますが、非特異的バンドを認めることは多いです。
添付文書をみると、内在性レベルのTyr416 がリン酸化されたSrc タンパク質を検出するものです。また同等の位置がリン酸化されたSrc ファミリータンパク質（Lyn、Fyn、Lck、Yes、Hck）と交差反応する可能性があるようです。リン酸化されたRTK タンパク質とは交差反応する可能性がある、と指摘されていました。
とは言っても非特異的バンドは薄いことが多かったのですが、今回は濃いものがあったので疑問に感じました。
ありがとうございました。