- ベストアンサー
GST融合タンパク質発現ベクターpGEX6Pについて
- 現在、GST融合タンパク質を発現、精製するためにpGEX6P-1というベクターを使用しています。培養条件や精製方法について質問があります。
- タンパク質の精製時に、GST融合タンパク質の他にGSTそのものも発現してしまう現象が起きています。このようなことは一般的なのでしょうか？
- GSTの発現量が多くなってしまっており、目的タンパク質の収率が低下している状況です。アドバイスをいただきたいです。
- みんなの回答 （4）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
融合タンパク質発現用のプラスミドを作った際に、single colony isolationが不十分だったのではないでしょうか？ その株からプラスミド取って1カットの制限酵素で切断したらバンド2本見えませんか？
その他の回答 (3)
- nativepage
- ベストアンサー率40% (24/60)
なるほど、目的タンパク質はインクルージョンボディでGSTは可溶性というのはよくある話ですね。別にベクターのせいではないです。 インクルージョンボディを溶解してリフォールドするか、目的タンパク質の全長が必要ないのであれば、どちらかの末端を削って可溶性画分にこないか試すといったところでしょうか。 また、わずかでも可溶性な全長タンパク質が取れているのであれば、リットル単位で培養ののち、目的タンパクとGSTを適当な方法で分離、精製という力業が意外と解決の近道だったりします。
補足
やっぱり一般的にあるんですか？？？ GSTそのものが発現(分解産物？)しちゃうケースって。 リフォールディングって個人的にあんまり信じてなくて。。。 やっぱり、ファーメンターで10L培養ですかね。
- nativepage
- ベストアンサー率40% (24/60)
目的タンパク質のアミノ酸配列によっては、途中で翻訳が停止しやすかったり部分分解しやすかったりするので、そのせいかもしれません。 目的タンパク質も発現しているのならば、一度ゲルろ過などで目的タンパクとGSTを分離してしまうのも手です。
補足
そうですね。。。 その手は考えておりました。 ただインサートの異なるものでも、 同様な現象が起きているので、 ベクターの仕様なのかなぁとも思っているところです。 (シーケンスからコンストラクトは問題ないと思っているので。) ゲルろ過、アフィニティ、消化、ゲルろ過(and, or)イオン交換がよさそうですよね。 インクルージョンボディも結構多くて、 収量があまり期待できないってのも難点です。 結構はまってますよね。。
- miya_0726
- ベストアンサー率54% (94/173)
ANo.1です。 とすると、融合部分が微妙に異なるクローンが混ざっている可能性は考えられませんか？ 融合部分周辺のシーケンスは実施されましたか？
補足
形質転換後、必ずシングルコロニーを複数個拾って制限酵素消化による確認を行い、シーケンスを読んであたりをみつけているのですが。。。もちろん融合部も確認しております。
補足
回答ありがとうございます。 電気泳動からもシングルコロニーが得られていると思っております。 しかも異なる3クローン作って全てこのような現象が起きているので。。。 一般的な話ではないですかね？？