GST融合タンパク

質問

現在、目的のたんぱく質をGST融合タンパクとして大腸菌内で発現させ、アフィニティーカラムを用いて精製を行っています。上清には十分量でてきているのですがカラムを通してもほとんど吸着しません。しかも少ないながらも吸着したものを溶出してもでてきません。グルタチオン濃度を上げてみましたが変わりませんでした。トラブルシューティングを参考にしながら考えられるところを変えてみましたが改善されませんでした。周囲の人に聞いても良い回答は得られませんでした。現在のところ目的のタンパク質の構造による影響と考えていますが、このままではいつまでたっても十分量精製できないので非常に困っています。同じ様な経験がある方、こんなふうにしたら解決したなどありましたらおねがいしますm(_ _)m ちなみに目的としているタンパク質は20kDaです。

回答No.3

noname#55430 · ベストアンサー

カラムに通すときのpHはあげてみましたか？8.0くらいまであげると結合が改善することがあります。また、菌体量に対する、buffer量はどれぐらいですか？
あまり少ないと、破砕したときにpHが下がってうまくいきません。
５－１０倍入れた方が確実です。
破壊するときのバッファーの組成は？PBS使用ですか？
思い切って、NaClを抜いてしまってもよいかもしれません。
なくてもノンスペはそんなにつかないから。
少しデタージェントと加えても変わります。あんまり入れるとよけいにつかなくなりますけど。

最後の溶出はfluoriteさんがいわれるように塩を加えて溶出をすすめます。
出てこないというのは、カラムを最後SDSなどで洗った結果ですよね。

上清にあるようでしたら、陰イオンー陽イオンカラムと普通に通した方がはやいようなきもします。どちらもそんなに高い物ではないですから。
その後、アフィニティーに通すと結果が変わることもあります。

お礼

ありがとうございます。ゲル濾過を試してみようと思います。また、ベクターを変えることも検討中です。

回答No.2

fluorite

後，考えられる対策としては結合BufのpHを範囲内で変えてみるとか，
NaClを加えて溶出Bufのイオン強度を上げることぐらいしか思いつきません．．．
また，分子量の小さいタンパク質の溶出には通常より多量の溶出Buf．がいるはずですので
少し流速を下げて長めに溶出を行うともしかしたら出てくるかもしれません．
一般的なアドバイスしか出来なくて申し訳ないです．

考えたくないことですが，融合させているタンパク質がGSTの構造変化を起こしていて
結合出来なくなっていると云うこともあるかもしれません．

私も今精製しているタンパク質がどうしても不溶性画分に出てきてしまうので
リフォールディングをどうしようかと思案中です．

タンパク精製は個々の特性があって大変だとは思いますが頑張ってください．

お礼

ありがとうございます。タンパク精製で苦労しているのは自分だけではないと知り少し気が楽になりました。がんばります。

回答No.1

fluorite

詳しい精製条件が解らないのでなんとも云えないのですが，
菌体は超音波処理で破砕してるのでしょうか？やりすぎると
タンパク質が変性してカラムに結合しなくなることが時々あると
聞きました．
また，破砕するときのbufferに終濃度5mMになるようDTTを加えると
改善されることがあると云うことですが，試されましたか？

私はHisタグ融合タンパク質しか精製したことがないので
友人から聞いた話で，申し訳ないのですが．．．．．．

でも，恐らく一般的なトラブルシューティングだと思いますので
既に試されてたら申し訳ありません．
それと，どんなことを試されたのか書いていただけると助かります．

お礼

早速の回答ありがとうございます。試したことについて詳しく書きませんでした、ごめんなさい。破砕するときのバッファーにDTTを加えてみたことがありますが改善しませんでした。あとはカラムを通す前にDNase処理をしたこともあります。ちなみにフリーのGST（これはGST融合タンパクより明らかに少ない）はカラムに結合しているようで、溶出すると太いバンドとして検出できました。