組換えタンパク質の発現について初めての質問です。

質問

組換えタンパク質の発現について初めての質問です。

現在ある遺伝子を発現ベクターに組み込んでHisタグタンパク質の発現誘導条件の検討をおこなっています。以前同様の遺伝子でGSTタグを用いて組換えタンパク質を発現することができたことから、今回25、37℃での培養を行い(IPTGの終濃度1mM,0.5mM)、超音波処理による菌体破砕後、ゲル染色、ウエスタンで確認しましたが発現しているか確認することができませんでした。
羊土社の書籍を見ながら検討していることは、(1)培養温度をもう少し低くする(20℃)、(2)超音波処理の予備実験(今まで予備実験をおこなっていないのでタンパク質が失活・変性していると考え試薬による大腸破砕を検討中)、(3)プロテアーゼ阻害剤の使用　等を考えています。
その他にどのようなことを検討すればいいかアドバイスいただけませんか？よろしくお願いします。

ちなみに発現ベクターはpQEベクターで20-30kDa付近にバンドがでると予想しています。

回答No.1

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(3)は基本ですね…。
それはさておき、発現したのかしなかったのか、
をまず確認した方がよいと思います。

菌体破砕後に遠心しますよね？
遠心後の上清には、目的の蛋白質がなかったんだと思いますが、
ペレットにあるかどうかは確認しましたか？
ペレットに目的蛋白質が大量にある場合、質問に書かれている
(1)や破砕の際にTritonなど入れてみる、IPTGもっと下げてみる、
pColdベクターを使ってみる、など試す価値はあると思います。

また、ペレットを尿素などで溶かしてから、
透析で尿素を段階的に抜いていき、最終的に尿素をゼロにしても
可溶性を保てるようにするリフォールディングという手法も
あります（成功率は低いように思いますが）。
抗体作るぐらいだったら、ペレットをSDSで溶かしてそのまま
免疫してもいいと思いますが笑

一方、ペレットにもない場合、
大腸菌の中でうまく発現できないということなので、
単純にコンピテントセルを替えてみるとか、CodonPlusを
使ってみるとか。

というか、GST fusionではなぜだめなのか、とか、
GSTを精製後にプロテアーゼで除去できないのか、とか、
考えてしまうのですが…

GST fusionで可溶化できてもHisタグでは凝集してしまう、
なんてことは日常茶飯事ですので、めげずに頑張ってください。

お礼

回答ありがとうございます。
可溶性画分だけでなく不溶性画分を泳動して確認しましたが目的のタンパク質は発現されていませんでした。シークエンスで確認したので読み枠はずれていないと思いますが…
回答していただいた内容を参考にめげずに頑張りたいと思います。