タンパクの発現に関して

質問

あるタンパクの発現を試みているのですがまったく発現しません。意見をいただけると幸いです。よろしくお願いします。以下条件です。

使用ベクター：Qiagen pQE30
発現させるタンパクの由来、鎖長：植物由来、約800bp
ホスト：E.coli M15[pREP4]およびBL21(DE3)plyS
培養条件：37℃で培養後、OD600=0.6のとき1mM IPTGを添加、その後25℃で一晩培養。

そのほか、SDS-PAGEにて可溶性・不溶性画分どちらも調べましたが、目的タンパクはありませんでした。ベクター＆インサートDNAはBamHIおよびPstIで切断し、ライゲーションしました。シークエンスも確認しましたが問題ありません。

必要なことがあれば追加します。どんな些細なことでもかまいません。どしどし意見をお願いします。

回答No.3

mousevshuman · ベストアンサー

pQEベクターで発現しない場合にはpETを使って見てください　一般的にpETの方が良く発現するような気がします　タンパク単体では出なくても融合タンパクにすると出る場合もあります　それと、コドンも確認してください　レアコドンが続いていると発現しにくい場合があります　いずれにせよ、タンパクの発現はあまり一般則がないので不毛でもとにかくいろいろやってみる必要がありますね　それでだめなら、大腸菌系は有効でないかもしれないのでTNTを使うとか真核細胞系を使うとかした方がいいと思います　大腸菌での細かな発現条件検討は、可溶性を高めるとか発現量を増やすのには有効ですが、出ないものを出すのにはあまりいいとは思いません

お礼

なるほどやはりpETですね。もしくはpGEXを使おうかと考えていたところでした。レアコドンに関してももう一度確認してみます。
あとは大腸菌以外で発現させることも視野に入れたいと思います。とりあえずは真核細胞ですね。資金調達できたらTNTもやってみたいです。
ありがとうございました。

回答No.2

MIYD

ポジコンなどがちゃんとおかれているのならば
後はその蛋白の性質次第としか言いようがありません。

未精製の状態でCBBで見えないのでしたら
一度ニッケルカラムで精製してみるか、
もしくはそのままトランスファーしてanti-hisでWBして発現が見られるのかを調べてみてはいかがでしょうか。

そこで物が出来ているのが確認できれば
最悪力技で何とか出来ますし。
精製した蛋白の使用目的にもよりますが。

お礼

もしかしたら微量にあるかもですね。試してみたいと思います。ありがとうございます。

回答No.1

MIYD

配列は本当にあっていますか。
フレームもあっていますか。
それともhisタグ用のfirst ATGを無視して別にATGを入れているのですか。

コロニーは何クローンくらい試していますか。

ラボですでに発現するとわかっているベクターをポジコンとしていっしょにやっていますか。

SDS-PAGEの後の検出はhisか目的蛋白でのWBでしょうか、
それともCBBなどで変化のあるバンドを見ているのでしょうか。

IPTGの濃度をふったことがありますか。
(0.1～5mMくらいまで見たことがあります)

IPTG添加後に温度を20度まで下げて振ったことはありますか。

辺りも書いたほうが回答を得られやすいのではないでしょうか

補足

補足要求に関しては以下のとおりです。

・配列は2度確認しているので間違いありません。もちろんフレームもあっています。His-Tagのfirst ATGを利用しています。
・コロニーは10クローン程度試しています。
・ポジコンも行っていますが問題ありません。
・SDS-PAGEはCBB染色にてコントロールと比較しています。発現するタンパクの大きさはわかっているのでマーカーとの比較も行っています。
・IPTGの濃度はまだふっていません。今後試してみたいと思います。
・IPTG添加後の温度は30、25、18℃で試しました。

以上です。お願いします。