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タンパクの精製についての質問
- GSTタグ融合タンパクをG-sephaで精製している際、樹脂からの溶出がうまくいかない状況に困っています。高濃度の塩を使った溶出条件を試してみようと考えていますが、塩濃度の上げすぎによるタンパク変性の問題や、タグ付きタンパクが残る可能性について教えていただけませんか？
- また、タグ付きタンパクを塩を使って溶出した場合、タンパクの切断がうまく行われず、タグ付きタンパクやGSTタグのみが溶出する可能性があるのでしょうか？初心者のため、経験者の方のアドバイスをお待ちしています。
- タンパクの精製において、G-sephaを使ってGSTタグ融合タンパクを精製していますが、樹脂からの溶出がうまくいかない状況です。高濃度の塩を含むバッファでの溶出を検討していますが、塩濃度の上げすぎによるタンパク変性のリスクや、タグ付きタンパクが残る可能性について詳しく教えていただけませんか？経験のある方のアドバイスをお願いします。
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> 思い切って500mM～1Mの範囲で、条件を検討してみようかと思っています。 > 塩濃度を上げすぎるとタンパクに良くない（変性する）などの > 問題が出てくるでしょうか。 タンパク質によるのでなんとも言えませんが、 タンパク質によっては沈殿してしまうことがありますが、 塩濃度の低い条件で沈殿しているならば溶出する可能性もあります。 貴重なサンプルでしたら、100uL程度の樹脂をエッペンに移して 遠心＆SDS-PAGEで溶出条件をテストしてみたらいかがでしょうか？ あと、ちゃんと切断反応が進んだ事は確認しましたよね？ 切断がいってて溶出してこないなら、封入体になってるんでしょうね。 > また、1Mの塩が入っているbufferで溶出しても後に透析などで > 塩を除けば大丈夫なものなのでしょうか。 沈殿してなければ大丈夫です。 ただし透析前後で塩濃度が大きく違っているので、 複数回透析バッファを交換して念入りにした方がいいです。 また、溶出バッファで沈殿するならば、 透析で同じ様な条件に戻せば沈殿する可能性はあります。 > また、塩で溶出した場合、Thrombinで切断されずに残ったGST融合タンパクが > タグ付きで出て来てしまう、切断はされたものの、 > GSTタグだけのものもG-sephaとの相互作用が弱くなって出てきてしまう、 > などのトラブルはありえますか。 GSTについてはおそらく大丈夫ですが、 もし結合後に1M塩バッファで樹脂を洗浄していないならば 多少は欲しいタンパク質以外のタンパク質も溶出されてくるでしょう。 普通は溶出バッファに近い条件で洗浄するので問題になりにくいですが、 今回の場合洗浄と溶出でバッファ条件が大きく違うので仕方ありません。 （私の場合は切断前の時点でなるべく綺麗にしておきたいので、 普段から界面活性剤や1M塩で軽く洗浄するようにしています。）
補足
>もし結合後に1M塩バッファで樹脂を洗浄していないならば 多少は欲しいタンパク質以外のタンパク質も溶出されてくるでしょう。 1Mの塩でWashというのはやったことがないのですが、1MでWashしてもG-sephaとGSTタグの相互作用 には影響がない、ということですよね？ 自分の研究室では、塩は高くても300mM程度でしかWash bufferに入っていないので、これではWashの意味がないと考えた方が良いですか？