不溶性蛋白の可溶化（組み換え蛋白の発現）

質問

いつもお世話になっております。

組み換え蛋白をGST融合蛋白として発現させる系をおこなっております。
目的の蛋白が不溶姓にでてくるのですが、これを可溶化させるために次の方法を考えております。

1、界面活性剤を用いて再可溶化
2,cold発現ベクターでの発現

これ以外にこうやったら可溶化したよ、という方いらっしゃいましたらお教えいただけたら幸いです。

最初の可溶化はPBSにリゾチームを添加したもので凍結融解を10回くりかえして行っています。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

融合タンパク質をどのような目的で使うかによっても、好みが違ってくると思います。
私はこれまで収量重視の実験が多かったものですから、不溶性になってもあまり気にせず、目一杯発現誘導していました。しかし、Pull-down assayやGel-shiftのような実験をやっていた同僚たちは、たとえ収量を犠牲にしても、最初から可溶性になるように発現させる方法を選んでいました。たとえば、低温で発現誘導する、Periplasmに分泌されるとかthioredoxinと融合させるとかの宿主／ベクター系を使うなどです。

不溶化してInclusion bodyを形成してしまい可溶化する必要がある場合私はこうしています（出典はMolecular Cloningだったと思います）。
1. Inclusion bodyを蒸留水、またはPBSなどにピペッティングなどで懸濁、遠心。1～3回繰り返し可溶性成分を洗い落とす。

2. 沈殿に少量の10 mM EDTA (pH8)を加える（1L培養につき2 mL程度）

3. 等容量の8 M尿素を加え、30分間ステア。溶けがわるいようなら、さらに8 M尿素を加える。ここでTx100, Tween20などの界面活性剤、DTT、適当なpHのバッファーなどを加えると効果的な場合がある。

4. 遠心して不溶物を沈殿させ、上澄みを回収。

5. 2 M 尿素/5 mM DTT/0.2 mM EDTA→PBS（数回）で透析。または、アフィニティーカラム精製で許容できる尿素濃度（タグによって異なる）まで希釈してカラム精製（カラムの中で尿素濃度が下がると、そこで不溶化するおそれあり）。

界面活性剤は、透析で取り除きにくいので、界面活性剤が用途に影響がある場合は入れない方がいいでしょう。
逆に、界面活性剤が混在していても影響がないような場合は、溶菌するのに使ってもいいと思いますよ（凍結融解は、手間でしょう）。

お礼

詳細な説明ありがとうございました。
昨日から低温培養での誘導を試しております。
これで可溶化してくれることを祈っています。

だめなら教えていただいた方法を試してみます。

回答No.3

pen82

No.1です。

はじめから低温にすると、菌が増え始めるまでに時間がかかってしまうため、pre培養は、37度にしています。

本培養は、37度で開始し、徐々に温度を落として、誘導前に目的の温度まで持っていくようにしています。

お礼

補足説明有難うございます。
昨日から培養を行い今日集菌・可溶化します。
可溶化してくれるといいんですが・・

回答No.1

pen82

現在の培養は、何度で行っていますでしょうか？
培養を低温にするだけで、タンパク質が可溶化するようになることがあります。

２５℃や２０℃あたりで試してみるといいかもしれません。cold発現ベクターに変えなくても、今のベクターのままでもできます。

うまくいくといいですね。

お礼

すばやい回答ありがとうございます。
早速検討してみます。

誘導時の温度は37度で行っています。
pre培養はから低温に変えたほうがよろしいのでしょうか？