DNA配列の解析

質問

全長3kbpのDNAシークエンスを行おうとしているんですが初めてで混乱しています。サンプルはPCR産物でTOPOシークエンスベクターにまでつなぎ、kit内のプライマーでサイクルシークエンスをすることまでわかりました。ただ一度に読める配列が800bpほどなので複数回読む必要がありますが、２回目以降のプライマー設計がわかりません。一回目のシークエンス結果からプライマーを設計してよろしいのでしょうか。またそのときの注意点等がありましたら教えていただけないでしょうか。

回答No.2

dadachan · ベストアンサー

800bp読めるのでしたら、650bpあたりの配列をもちいてprimerをつくり、続きを読む。すると1500くらいまで読めるので1350bpあたりの配列を用いてその続きを読む・・・・
逆も同じく、3000から2200まで読めるのであれば2350PBあたりの配列を用いてその前を読む・・・

今やprimerは30pbでも2000円前後で、しかも翌日届くなんてサービスもありますから、すぐに出来ますよ。

まぁシークエンスでしたらそこまで気にする事はないですが、可能であればMIYDさんの言われるようにTm値に気をつける、それよりもGC:AT比を1:1に出来るだけ近づければいいんじゃないでしょうかね。

TOPOはとてもおとなしいですから、シークエンスの邪魔をするような配列はありませんし。

お礼

アドバイスありがとうございました。すぐにでも始めようと思ったのですが、シークエンスはお金がかかるのでもう少し勉強して成功率を上げてから実行しようと思います。

回答No.3

MIYD

もう読み終わっているかもしれませんが

BigDye terminator3.1で、プライマーの3'側7merが相同性がある配列がプラスミド中のほかのところにあったときに、
ダブルピークになって読めなかったことがありました。
普段は気にすることはありませんが、同じドメインが繰り返しあるような場合には気をつけたほうがいいかもしれません。

回答No.1

MIYD

そのやり方で大丈夫です
気を付けるのは特異性とTm値位でしょうか

一応、インサートを適切な制限酵素で切ってサブクローニングして読むという方法もありますが、
プライマーを発注出来るのならば、
歩いた方が簡単です

お礼

ありがとうございます。周りにシークエンスをやったことがある人がいなくて少々不安でした。これからプロトコルを作ってみようと思います。