シークエンスについて

質問

全塩基配列が解読されている遺伝子に対して
自作のプライマーを使用して特定部位の増幅を行っています。
自作プライマーで増幅した断片が
目的遺伝子由来かどうか検証するために
シークエンスして調べようと思うのですが
その際のシークエンスサンプル本数はどのくらいで
信憑性がある結果と言えるのでしょうか？

回答No.1

blackdragon · ベストアンサー

目的遺伝子由来かを調べるだけなら１本でいいでしょうね。
（非常に配列の近い遺伝子が複数存在するのでなければ、いくつかの制限酵素で切って、電気泳動でそのサイズが予測されるパターンと同じであることを確認するだけでも大丈夫でしょうが。）

増幅による変異が入っていないことを確かめたいなら、数本は読んだほうがいいでしょうが。（変異が入っていないものを得るのに必要なサンプル数は、PCRのサイクル数や使ったポリメラーゼなどによって変わります）

お礼

早速のご回答ありがとうございました。
初めての試みなので、どれぐらいがベストなのかわからず…。
参考にさせていただきます。

回答No.3

gc-ms

シークエンスサンプルは一つで良いです。

すでに行ったかもしれませんが，
電気泳動からもある程度判断できます。
1）ステップラダーと同時に泳動し，増幅断片の大きさを確認する。（これはだれでもやっているでしょう。）

2）自作したプライマーが本当に鋳型に対して特異的なものかどうかを調べるために，フォワードのみとリバースのみの反応を行い，電気泳動でチェック。バンドが予想されるサイズのところに見られなければOK（これもステップラダーと同時にながします）.さらに，ネガティブコントロール（鋳型を入れないやつ）を作り，プライマー自身による非特異的産物が無いかどうかチェック。

結局は，シークエンスデータから目的遺伝子由来かどうかを判断することになるのですが，シークエンスにはお金と時間がかかりますから…。もし，やっていなのでしたら，お試しください。

お礼

２）に関して、ネガティブコントロールによるチェックの必要性は知っていましたが、F.W.のみ、R.V.のみでPCRを行い電気泳動パターンから確認するという方法は初耳でした(超初心者なもので・・・）
とても興味深く、是非やってみたいと思います!
有り難うございました。

回答No.2

geneticist12

PCR産物をダイレクトにシークエンスするなら、一反応で十分。同じチューブからとったサンプルで、replicateをいくつとったところで同じ結果になるので意味ないです。
また、既知の遺伝子と一致しているかどうかを判断できれば十分なら、精密さもあまり求めなくてもいいでしょう。

ただし、PCR産物をクロニーングした場合、個々ののDNAクローンには、耐熱性ポリメラーゼのヌクレオチド取り込みエラーによって、いろいろな変異が入っている可能性があります。ここから、未知の配列を決定する場合や、正確な配列をもったクローンを得たい場合など、多くのクローンのシークエンスをし、比較する必要があります。

お礼

今回PCR産物のクローニングは行っていないので
後者の場合の考慮は不要なのですが、
今後のためのよい参考になりました。
有り難うございました。