断片同士のライゲーション

質問

ベクターとインサートのライゲーションというのはごく普通に聞くのですが、断片同士のライゲーションというのは可能なのでしょうか。
実際に今試みているのですが、電気泳動で確認したところ２つの断片の合計長よりも長いところに断片が出てしまう状況が続いていて困っています。
原因がわかる方、断片同士のライゲーションの基本的プロトコルのようなものをお持ちの方がいらっしゃいましたらどうぞご回答の方をよろしくお願いします。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

(Acc-Eco)+(Eco-Kpn)を作ろうとしているのですね。

ほかの解答にもあるように、非常にたくさんの断片が重合しているのだと思います。
AE+EKだけでなく、AE+EA, KE+EKもあり得るはずですし、さらにA末端同士、K末端同士もLigationしますから。

ぼやけたバンドだと言うことから特定の長さというのではなく、10 kb 以上いろいろなサイズで重合しているのがゲルの分画範囲を超えているためにそう見えているのでしょう。5 kb付近はひょっとすると環状化したものかもしれません。

でももしそうだとしたら、ligation産物をAccIとKpnIで消化してやればAcc-Kpn 2.3 kb, Acc-Acc 2.8 kb, Kpn-Kpn 1.8 kbのバンドが現れるはずですね。それで目的は達するのでは？

それと確認事項ですが、
Eco81Iは認識／切断配列にNがありますが、ここはくっつけようとしている末端同士で相補になっていますか？
そうでなければAE同士、EK同士のligationしか起こりません。
また、タカラのカタログによるとこの酵素で切った末端は非常にligationしにくいそうですが、うまくいっているのでしょうか？

お礼

ご回答ありがとうございました。

補足

＞ligation産物をAccIとKpnIで消化してやればAcc-
＞Kpn 2.3 kb, Acc-Acc 2.8 kb, Kpn-Kpn 1.8 kbのバ＞ンドが現れるはずですね。

やってみようと思います。
これは、ライゲーションサンプルをそのまま制限酵素処理にかければいいのでしょうか？

＞それと確認事項ですが、
＞Eco81Iは認識／切断配列にNがありますが、ここはく＞っつけようとしている末端同士で相補になっていま＞すか？

各断片は、もともとゲノムのつながった配列を断片的にクローニングしたものですので、相補になっております。

＞また、タカラのカタログによるとこの酵素で切った＞末端は非常にligationしにくいそうですが、うまく＞いっているのでしょうか？

今回の条件ではないのですが、
インサートとベクターのライゲーションでEco81Iを使用したときには
ちゃんとライゲーションできていましたので、
Eco81Iには問題がないと思うのですが。。。

よろしくお願いいたします。

回答No.4

geneticist12

>これは、ライゲーションサンプルをそのまま制限酵素処理にかければいいのでしょうか？

エタノール沈殿等でバッファーの交換・Ligaseの失活の必要はありますが。

>各断片は、もともとゲノムのつながった配列を断片的にクローニングしたものですので、相補になっております。

ということはEco81I末端はAE対EKのときのみ相補と言うことですね。じゃあ、

＞igation産物をAccIとKpnIで消化してやればAcc-Kpn 2.3 kb, Acc-Acc 2.8 kb, Kpn-Kpn 1.8 kbのバンドが現れるはずですね。

後二者はでてきませんね。

回答No.2

MIYD

切り出した各フラグメントを泳動してチェックして
おかしなバンドが無いというのは確認されていると思います。
また、Acc65I、KpnI側の末端はアルカリフォスファターゼ処理されていないという前提で答えると、

1同士、2同士の末端が結合できるのが原因ではないでしょうか。

ライゲーションしていない元のサイズ(1.4kb,0.9kb)のバンドがぜんぜん見えないくらいライゲーションがうまくいっているのでしたら、

O/Nで反応させたために
AccI-(1)-Eco81IーEco81I-(2)-KpnI
だけで反応が終わらずに
その両端にさらに各フラグメントがライゲーションして

AccI-(1)-Eco81IーEco81I-(1)-AccI－AccI-(1)-Eco81Iー‥‥

や

Eco81I-(2)-KpnIーKpnI-(2)-Eco81IーEco81I-(2)-KpnI－‥‥

や両方が混ざっている断片ができているのではないでしょうか。

この場合ならば2本のバンドにはならずにラダー(はしご状)のバンドが出てくると思いますので、
なぜ2本になっているのかはわかりません。

もしかしたらある程度(5kb)くっついたら、高次構造をとるようになってライゲーションしにくくなって、
中にはもう一回ライゲーションする(10kb)ものが出てきているのかもしれませんが、
ちょっと考え方に無理がありますし、確認する意味も無いと思います。

とりあえず反応をO/Nではなくて5^30分位にしてみてはいかがでしょうか。

お礼

ご回答ありがとうございました。

補足

確かに同じ断片同士が結合してしまっているのではないか、とは思いました。
今度はご指摘の通り、ライゲーション反応を短くして試してみようと思います。
ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

3ピースライゲーション(ベクターとインサート2つ)
のプロトコルもありますし、
断片同士でも末端が合えばライゲーションします。

>2つの断片の合計長よりも長いところ
プロトコル(DNAの末端や濃度、DNA断片の調整方法など)を見ないとわかりませんが、
両側に結合できる末端があるのならば、
3つ以上ライゲーションしたものなのかもしれません。

お礼

回答ありがとうございます。

補足

両端をAccI－Eco81I（(1)）、Eco81I－KpnI（(2)）で制限酵素処理し、
電気泳動後、アガロースゲルから切り出し、
精製した2つのDNA断片(1)（1.4kb）、(2)（0.9kb）をモル比＝１：１で混合し、
TOYOBOのligation highをサンプルの半分量加え、16℃、over nightで反応させました。
このライゲーションサンプルを電気泳動してみたところ、
2.3kb（(1)＋(2)）付近にはバンドが得られず、
10kb付近と5kb付近にぼやけたバンドが出てしまいました。

なぜなのでしょう？？