ライゲーションがうまくいかない…(~_~;)

質問

分子生物学の研究をしているものです。pcDNA3.1(+)というベクターをNheIとApaIで切断して、ここに自分の設計したインサートを導入しようとライゲーションを行っているのですが、なかなかうまくいかず、セルフライゲーションばかり起きてしまいます。ベクター、インサート共にゲルからの切り出し精製を行っているので、断片が混じっているようなことはないと思いますが…。ライゲーションがうまくいかない要因としてヒントを頂けると助かります。
ちなみに、ベクターとインサートのモル比を1:8,1:40,1:80,1:160でライゲーションを行いましたが、いずれもセルフライゲーションが起きていました…(~_~;)

回答No.4

yuklamho · ベストアンサー

"確かに切れ残りがあるかもしれないですね。"
しれないじゃなくって、きちんと切れていない（のがたくさんある）からセルフライゲーションが起きるわけでしょ？2箇所とも切れていないか、片方だけしか切れていないかだと思います。

"ただ1つの制限酵素切断と、2つの制限酵素切断のバンド差が100bpぐらいで、ベクターサイズが5000bpくらいなので、区別が難しいです"
MCSのNheIとApaIの間にあるサイトの酵素でインサートにサイトがない酵素を選んでベクターのAmp遺伝子のところのScaIとかPvuIと一緒に切ったらインサートが入っているかどうか分かるんじゃないですのか？

お礼

ありがとうございます。色々検討してみます。

回答No.3

tatoo

プライマーみたいなものを、自分でアニーリングさせて
インサートとしたわけですね。

それならば、かなりbpが小さくなると思いますが、
それをゲルから切り出すとは、実際に可能かと疑います。

何を精製してしているのか、本当にきちんとアニーリングしているものを
精製しているのか、疑わしいです。

というか、私は自分でアニーリングさせて用いる場合、
ゲルかわ切り出したことありません。

私だったら、アニーリングしたであろう産物をインサートとして、
そのままライゲーションに用います。

あとは、そもそも、そんなにって効率はよくないいので、
ちょっと多めにプラスミドを取って調べます。

補足

インサートの長さは63bpほどで、50bp ladderと共に泳動してみたところ、50bpより少し大きめのところにバンドが出ていたので、アニーリングできてるのかと思ってました。精製している理由は、ヌクレオチドキナーゼ除去のためなんですけどね…(~_~;)

回答No.2

LSnyaa

私の知識不足であれば申し訳ないのですが、ベクターを2つの制限酵素で切断している限り、セルフライゲーションは起こりえないと思います。

セルフライゲーションが起こっているのであれば、制限酵素でベクターが切断されなかった、あるいは片方しか切断されなかったということが起きていると思うのですが、泳動結果を見て移動距離から判断できるのであれば一度そうしてみてはいかがでしょうか？

制限酵素処理の段階をもう一度よく見直してみてはどうでしょうか。

補足

御意見ありがとうございます。確かに切れ残りがあるかもしれないですね。ただ1つの制限酵素切断と、2つの制限酵素切断のバンド差が100bpぐらいで、ベクターサイズが5000bpくらいなので、区別が難しいです…(~_~;)

回答No.1

tatoo

もう少し状況がわからないと、
いろいろ可能性がありすぎてここには書ききれません。

インサートはどのように準備されたのでしょうか？

補足

自分の設計したインサートを、ネットで注文しました。オリゴヌクレオチドなので、フォワードとリバースの2種類です。もちろん両端はそれぞれ、NheI,ApaIと相補配列となるように設計しましたので、間違いはないと思います。
手順としては、
1.フォワードとリバース別々に5'末端のリン酸化
2.フォワードとリバース溶液を混ぜ、サーマルサイクラーで95度を5分。そのあと、室温で10分ほど放冷
3.2.を行った溶液について電気泳動。バンドを切り出して精製
以上の形になります。