遺伝子解析で（シーケンス反応）

質問

細菌から抽出したDNAをPCRで数を増やしますが、次に行うシーケンス反応の時もPCRと同じように温度を変化させた反応サイクルを繰り返しますよね。この時蛍光マーカされたddNTPがくっついた伸長停止した色々な長さのDNAができると思うのですが、その色々な長さのDNAを作るために数十サイクルも反応行うのですか？PCRの時はDNAが増えますが、シーケンス反応の時はDNA自体は増えませんよね？その時伸長停止したDNAは熱がかかった時に再度解けてしまうことはないのでしょうか。
又シーケンス反応の終わったサンプルを洗浄乾燥し、再溶解して自動解析機（キャピラリ電気泳動）にかけますが、移動するDNAは伸長の止まった２重螺旋の状態で移動しているのでしょうか？
それと、解析結果が例えばＡ・Ｇ・Ｔだったとしたら、ddNTPのＡ・Ｇ・Ｔが付いていたという事でしょうかそれともddNTPのＴ・Ｃ・Ａがついていたという事でしょうか。
色々聞いてしまってすいません。

回答No.1

noname#14952 · ベストアンサー

反応サイクルを繰り返すのは、転写産物を増やすためです。プライマーが片方にしかつかないので、指数関数的に増えるのではなく、直線的に増えていきます。ddNTPが取り込まれて伸長停止したDNA鎖は、次の熱変性で鋳型から離れ、温度が下がると再びプライマーがついて伸長を始めます。

反応産物は変性剤の存在化で電気泳動するので、１本鎖のままキャピラリの中を移動していきます。

解析結果がＡ・Ｇ・Ｔのときは、伸長したDNA鎖がＡ・Ｇ・Ｔを含んでいたことを示します。実際に検出されるのは、蛍光標識したddATP, ddGTP, ddTTPがそれぞれ酵素反応で伸長鎖の3'末端に取り込まれたものになります。

お礼

回答ありがとうございました！
良くわかりました。教えてくださり感謝します！