シークエンス反応について

質問

シークエンス解析の際、
PCRで
アニーリング５０℃、伸長６０℃の条件で行う必要があるらしいのですが、
なんででしょうか？
いろいろと調べたのですが、
わかりませんでした。
ご存知のかたよろしくお願いいたします。

回答No.3

hagfish

ひとついい忘れましたので付け加えます。シーケンス反応はPCRと同じ反応ですけど連鎖反応ではないですよね。つまり、アニーリング効率で反応効率（最終生成物の量）がすべて決まってしまうのです。いっぱんのPCRは連鎖反応なのでアニーリング効率が少しばかり悪くても（アニーリング率よりも正確性をとる）連鎖で最終生成物の量はすさまじい量になります。シーケンスはアニーリング率が悪ければ最終生成物の量に影響があるのです。

回答No.2

hagfish

おそらく、一般のPCRの場合とシーケーンスの伸長反応の時の違いを言っているのですよね。たしかにシーケンスはプライマー一本のPCRですので反応条件が異なるのはおかしいとお思いでしょう。
しかし、シーケンスの場合はPCR産物やプラスミドを用いるため、一般のPCRと比べて同じような配列が存在する確立が極めて低いことになります。つまりアニーリングミスの可能性が低いのです。一般にアニーリングは水素結合ですので温度が低いほうが結合率がいいことはお分かりですね。つまり、反応の効率を上げるため（アニーリング率上げるため）、より低い温度でPCRができるのです。そのため、シーケンス用の酵素は最適温度が低めの物を使いますし、アニーリング温度も下げることになります。
確率は低いですが偶然サンプル中に同じような配列があることもあります。そのときはアニーリング温度を変更するのが常套手段です。酵素はキットに入っている酵素が決まっていますので伸長反応時の温度（酵素の最適温度）は変更できませんがね

回答No.1

noname#9462

キットの説明書にそう書いてあるから、あるいは、メーカーによる条件の最適化の結果そうなったから、ということでは納得いかない？　それが気になる理由はなんでしょう？