PCR反応

質問

PCR反応で
Denature
anneling
Extension
の反応時間についてお尋ねします。
Extensionの時間はTaqの性能によって変えていますが、
DenatureとAnnelingの時間はどのように設定したらよいのでしょうか？
できるだけ短くしたいとおもうのですが、
私は今まで30秒～60秒をなんの根拠もなく設定していました。
5秒とかでやっている人もいることを知って驚きました。
この時間の条件検討などを行った論文や実験書はあるのでしょうか？
よろしくお願いいたします。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

機械の性能・仕様、それと熱容量や熱伝導度の関係で、チューブの仕様（厚みなど）、反応液量、ミネラルオイルの使用・不使用などによって違うと思います。

一般化するのが難しいので、条件検討が論文になっている例はないと思います。最適化するには、各自が自分の実験内容と実験環境で試すよりほかないと思います。
実際に参考になるのは、使っている機械や酵素の説明書にある設定条件でしょう。メーカーがさんざん条件検討したものですから。

だいたい教科書に出ているような条件は、機械の性能が低くて、PCR用の特別に薄いチューブがなかった頃のものもあり、denature, annealingの時間が長めだったりします。参考までに、私はP/E9700を使って、denature 15 sec. annealing 30 sec.というのがdefaultです
因に、9700は9600などにくらべ性能があがっているので、9600で決めた条件をそのまま使えるように、9600のスペックで走らせるモードがついていたりしますね。

回答No.4

nitscape

#1です。

＞お答えの内容は一般論（教科書通り）だと思いますが私の求めている情報ではありません。
＞実際二分、一分、二分でPCRをやっているのであればずいぶん時間の無駄遣いをしていると思います。
＞
＞できるだけPCRを早く終わらせるために、どこまで時間を短くできるのかを知りたいと思います。

まったくの検討違いの回答ですみませんでした。一般的な"誰がやっても成功する"というプロトコルの確立のものでこれに関しては条件検討の論文はあると思いますが...akiboooooさんが求めているPCRの方法についての条件検討の論文などはないと思います。

成功するぎりぎりのところまで早くするということですから、どうしてもマージンが小さくなります。このような方法に関してはプライマーやサンプルの影響が大きいです。そのためご自分で条件検討をすることになると思います。

マージンが小さいということでちょっと条件が変わるとPCRが失敗することも考えられます。私も学部の頃などは面倒な処理は（自分なりの考えに基づいて）省略したり、時間を短くするようなことをしましたが、そうすると実験結果のばらつきが大きくなり、もう一度やり直しなんてことがよくありました。確かな実験結果を残すためにも確立されたプロトコルで実験した方がいいと思います。

回答No.3

geneticist12

書き忘れを補足

あと、もちろんどんなターゲットをどんなプライマーで増やすかにもよります。

短いターゲットなら、短時間で十分denatureしますし、長いプライマーならannealingの時間も、annealing温度への移行時間も短くてすみます。touch-down PCRができるくらいプライマーが長ければ（Tmが高ければ）、annealingのステップを飛ばして、いきなりextensionでいいですものね。

回答No.1

nitscape

2分、1分、勾配2分でやっていました。

＞5秒とかでやっている人もいることを知って驚きました
とありますが設定上の話しであり、反応液の温度が一瞬で変わるわけではないと思います。言ってみれば勾配をゆっくり目にして反応（解離や結合）が十分進めばゼロ秒でも問題ありません。

また時間や温度の設定は使用するサンプルによって異なります。AT含量が多ければdenature時間は短くてすみますが、逆にGC含量が多いと長くなります。

＞この時間の条件検討などを行った論文や実験書はあるのでしょうか？
私は調べていないので分かりませんがPCRが開発された初期の論文を当たれば条件検討などの論文は見つかると思います。

補足

お答えの内容は一般論（教科書通り）だと思いますが私の求めている情報ではありません。
実際二分、一分、二分でPCRをやっているのであればずいぶん時間の無駄遣いをしていると思います。

できるだけPCRを早く終わらせるために、どこまで時間を短くできるのかを知りたいと思います。