リアルタイムPCRのアニール温度について

質問

現在BioradのOpticonリアルタイムPCRマシーンを使っています。
Melting Temperatureを見ると設計したプライマーによるPCR産物が100bpから130bpであるため大体80度以上になっています。
今まではPCRをかけるときにアニール温度を前の実験者がやっていたように55度で行っているのですが、より早く終わらせることが出来ないかなと思うようになりました。

94度30秒、55度30秒、72度30秒という設計ですが、
Melting Temperatureが80度以上ならアニール温度を72度に設定できないかと思うのです。
たとえば94度30秒、72度45秒とかにして、アニール温度とエクステンションの温度を続けてやってしまうのもいいのかと思うのです。
こうすればさらに特異性も増すのではないかと思うのですが、
みなさんは何度の設定を使っていますか？

回答No.5

tomoyaok

ロシュのライトサイクラーでＳＹＢＲーＧでやった仕事ですが、
45 cycles of 15 sec at 94°C, 10 sec at 68°C, and 20 sec at 72°C (Food sci. technol. Res. 11, 344-348)
アニールを７２にしなかったのは非特異的増幅が見られるようになったからで
それがなければ７２でもいいのではないでしょうか。

回答No.4

noname#160718

ほんっとにすもません。No.2です。
　No.3でTaKaRaの方はNo.1の方と同じモノと書いたのですが、No.1さんはSybr-Green方でやっておられるようなので、違うものですね。私はTaqMan法でしかやっていないので。
　(No.2ではCyber-Greenと書きましたが、もちろんSybr-Greenの間違いです)

　なお、今7500のマニュアルを見ていたのですが、"ガイドラインに基づいた反応条件"では、95℃15sec、60℃1minを40サイクルとなっていました。なんだ、いつも私がやっている条件と同じではないか。
　この時の酵素はもちろん、ABI(PE)のAmpli Taq-Gold activationです。
　つまりNo.3で私がTaqMan premixと書いたモノと同じです。

回答No.3

noname#160718

No.2です。
　すいません。大事なことを書き忘れていました。
　酵素はABIのTaqMan premixとTaKaRaのpremixです。TaKaRaの方はNo.1さんと同じモノだと思います。
　両方同じプロトコルで動かしています。

回答No.2

noname#160718

ABIの7500を使用しています。まあ機械はあまり関係ないとは思いますが。

　Melting Temp.とは私はあまり耳慣れない言葉なのですが、Denature Temp.のことだと理解して良いのでしょうね。この温度はPCR産物の長さには依存しないはずです。ノーマルPCRでもリアルタイムでも、だいたい94℃とか95℃とかに設定すると思います。

　アニール温度ですが、TaqMan法かCyber-Green法かで考え方が少し変わるような気もするのですが、実際のプロトコルを見るとあまり関係がないようにも思えます。

　で、私がやっているプロトコルですが、95℃15sec、60℃1minを40サイクル、という形です。60℃でアニールとエクステンションを同時にやっているということですね。

　こういうやり方はリアルタイムだけではなく、ノーマルPCRでもしばしば見かけます。私も何度かやったことがあります。

　アニール温度はプライマーのTm値に依存するので、いくらなんでも72℃でアニールという設計は無茶なような気がします。特異性の向上以前に反応しないような気が。
　アニール＆エクステンションというプロトコルは文献でもしばしば見かけますが、設定温度は高くても65℃までという記憶です。まあ私が見てないだけかもしれませんが。

　むろん、Tm値が極端に低いプライマーでこのプロトコルだと、上手く動かない可能性はあると思うのですが。リアルタイムに関してはまだ経験が少ないのであまりはっきりしたことは判りません。

回答No.1

sachihappy777

ストラタジーンのMx3005P使ってSYBRで行っています。
機械では72度のエクステンションが必要ですが、
酵素（TakaraのpreMix）の説明書ではエクステンションが必要ないと
あったため
95度15秒60度30秒で行っています。
（PCR産物は150bp前後）
72度15秒をいれた設定と比較してみたところ、差はなかったので72度なしのランを行っています。
（invitorogenのPreMixでも試してみましたがこちらはあんまりよろしくなかったので・・）

質問者様の使用されている酵素にもよると思います。
実際に試されてみてそれから検討されるのが一番かと思います。
時間削って結果が・・・でしたら意味ありませんからね。