プロモーター領域について

質問

現在、研究でとある遺伝子のクローニング実験を行っています。その遺伝子は、NCBIで調べ、その遺伝子の塩基配列が図示されました。その遺伝子の転写開始部位から下流に-10bpぐらいのとこからリバースプライマーを設計し、レフトプライマーを上流500、1000、2000bpで設計しました。なぜその遺伝子のプロモーター領域を増幅させるのでしょうか？

また、DNAの転写因子の結合部位予測を調べる理由はなんなんでしょうか？プライマー３というサイトでプライマーデザインを行い、そこに表示されたプライマーを色々いじくり使用しているのですが。

回答No.4

geneticist12

真核生物で一般的にinitiation siteから-20～-25 bp（TATA boxなど）と-40～-110 bp（CAAT boxなど）あたりにプロモータがあるとされています。これはinitiation siteから転写が開始さるための最小限のコアプロモータでで、これだけでは低レベルの構成的発現しかできません。遺伝子個有の発現調節のためには、さらにエンハンサー領域が必要で、その距離や位置（上流、下流、転写量域内）は多様です。

コアプロモータと、それと近傍の上流域にあり、その遺伝子の基本的な発現を促す働きの強いエンハンサーをひっくるめて、広い意味で「プロモータ」と呼ぶこともあり、今回はこれを狙っているのでしょう。

回答No.3

oil-sour

#1です。

ええと、ということは、もう疑問は解決していると思うのですが・・・
プロモーター領域をPCRで増幅し、ベクターに組み込むということですね。

プロモーター領域をpGL3に入れてルシフェラーゼアッセイで転写活性を見たり、結合する転写因子を解析したりするのでしょうか。いいんじゃないすか？

回答No.2

dolphino

>なぜその遺伝子のプロモーター領域を増幅させるのでしょうか？

>プロモーター領域の解析を行おうとしています。

答えが出ているようですが、何が質問なのでしょうか？

回答No.1

oil-sour

遺伝子（タンパク質のコード領域）の構造解析、つまりDNA塩基配列の決定がしたいのですか？　それとも転写活性など、プロモーター領域に関する研究がしたいのですか？

文章から察すると、おそらく遺伝子の構造解析をしたいのではないかと思いますが、そうであればあなたが設計しているプライマーの場所は間違っています。
どうやらプロモーター領域の解析をしようとしているように見えます。

あと用語に関してですが、上流と下流、リバースプライマーとレフト（？）プライマーについて、もういちど確認していただけますか？

お礼

ご回答ありがとうございます。
プロモーター領域の解析を行おうとしています。

NCBIで調べたのは、DCTという遺伝子のmRNA配列を調べました。
reverse primerとforward primerの間違いでした！reverse primerはright primer、forward primerはleft primerと呼んでます。

文章が色々間違っているっぽいです；；；

下流に-10bpといったのは間違いで、転写開始部位を+1として約+10bpのところにreverse primerを作りました。-5/+11の場所です。