定量PCRのスタンダード作製

質問

最近、リアルタイムPCRで増幅産物の定量を行うようになったのですが、
市販されているプライマーとスタンダードのセットでしか測定をしたことがありません。

自身でデザインしたプライマーで増幅した産物の定量を行いたい場合、
スタンダードはどのように作製したら良いのでしょうか？

PCRの増幅産物をプラスミドにクローニングしてスタンダードを作製するようなことを読んだのですが、悲しいことに理解できずにおります。
また、塩基配列が判明している変異遺伝子やウイルス検出にあたり、手元に陽性コントロールとなるサンプルがないとスタンダードを作ることは無理でしょうか？

具体的な解説、初心者向けのおすすめ書籍・webサイト等がありましたら、教えてもらえないでしょうか。

回答No.1

oil-sour · ベストアンサー

リアルタイムならやはりApplied Biosystemsが詳しいです。
アプリケーションマニュアルもご専門にあわせてどうぞ。

http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/ctlgpage.jsp?PLCD=46

私の場合、スタンダードは増幅がかかるターゲットよりちょい広め(200bpくらい？）のPCR産物を精製して、分子数に換算しています。
収量(重さと濃度）から分子数(mol)への変換はよろしいでしょうか。
（realtime RT-PCRですよね？）本来はRTaseのネガティブコントロールをとりたいので、スタンダードもRNAである方が望ましいのですが、難しいことが多いのでDNAでスタンダードをとっています。

2検体間での発現量の比較定量をするのであればもっと気軽にddCt法がありますが、ウイルスの検出ということであれば絶対定量が望ましいので、スタンダードをおくしかないと思います。

お礼

ご回答ありがとうございます。
Applied Biosystemsのページを拝見させてもらいました。

DNAの濃度を測定し、計算によりDNA 1分子あたりの重量を求めることでコピー数を算出するということでよろしいでしょうか。

> スタンダードは増幅がかかるターゲットよりちょい広め(200bpくらい？）のPCR産物を精製
とありますが、具体的にはどのような手法で精製するのでしょうか？
人工合成ではなく、実際の系より広い範囲を増幅するプライマーを利用して、スタンダード用のPCR産物を精製しているということでしょうか？
また、スタンダード作製には手元に陽性コントロールがないと無理でしょうか？

ddCt法についても勉強させていただきます。

可能でしたら、補足説明していただけると幸いです。

回答No.2

oil-sour

#1です。

＞実際の系より広い範囲を増幅するプライマーを利用して、スタンダード用のPCR産物を精製しているということでしょうか？

仰る通りです。
ターゲットとなる配列を含む領域をPCR増幅し、それを簡単に精製（kitなどでカラム精製、脱プライマと脱塩）します。
この標準品を段階希釈系列にして、検体が収まる様なスタンダードカーブを描いています。
私は微生物系の研究者ですが、いまのところこれで文句を言われたことはありません。（mRNAの発現量の相対定量が主な目的だからかもしれませんが）

RNAの検出が目的のようですが、陽性コントロールを得るのに一番手軽なのは、T7プロモーターを持つベクターにクローニングし、T7RNAポリメラーゼでRNAをつくる方法だと思います。

お礼

丁寧な解説ありがとうござました。

PCRやクローニングを利用して陽性コントロールを作製しているのですね。
これからも色々と勉強してみたいと思います。

やはり1度は陽性サンプルを手に入れないとダメですね。

周りに知識のある人がいなかったので、とても助かりました。