大腸菌の超音波破砕について
大腸菌でタンパクを発現させ、超音波破砕をし、遠心して上清を回収することで、目的のタンパク質を回収する方法があります。目的のタンパクは、GSTなどの可溶性の高いタンパクを結合させることによりペリプラズム間に移行させます。
ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね?
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム&菌体内全部における可溶性の高いタンパクの回収したことになるのでしょうか?
また、上記の遠心後のペレットの方も上清画分と同様に、SDS-PAGEを行いました。ペレットにはかなり様々なバンドが濃く見えました。
(4)SDS-PAGEをすると菌体は全体が壊れると思いますが、これはSDS-PAGEにおいて泳動する前に、サンプルにSDSを入れてboilする過程において菌体が破裂するのですよね?
(5)界面活性剤(SDS)を加えただけでは、菌体は破壊できませんよね?(6)界面活性剤でペリプラズムのみ壊せているのでしょうか?
長くなりすみません。菌体が全部壊れているのか、ペリプラズムだけ壊れているのかよく分からなくなってしまったのです。
(7)最後に、凍結粉砕という方法もありますが、こちらも菌体全部壊れますよね?
大変こんがらがってしまいました。どなたか、よろしくお願いします。