リン酸化された蛋白の分析

質問

培養細胞から蛋白を抽出し、リン酸化蛋白をウェスタンブロッティングで同定する実験をしているのですがなかなかバンドがでません。ポジコンのリン酸化されてない蛋白はきちんとバンドがでてます。
リン酸化蛋白を抽出する際のlysis bufferや手技の留意点、SDS-PAGEの際の留意点等ありましたら教えて頂けませんか。

回答No.2

fujishiro · ベストアンサー

マクロファージはしたことがありませんが、通常、ERK系などのリン酸化タンパクを検出する際にはプロテアーゼ阻害剤やホスファターゼ阻害剤は必須ですね。
具体的には、同じ物を見てる論文を参考にするべきでしょう。detergent等の問題もありますからね。
私はEDTAなどのキレート剤、バナジン酸Na、フッ化Naやロイペプチン等をいれていますね。PMSFなども選択肢に入るでしょう。
氷上操作はもちろんですよ。遠心機等も冷却機能付のやつが望ましいです。洗浄等もするならPBSも冷やしておくべきです。

ボイルもしますよ。

泳動するときはポジコンはかならず用意するべきですよ。（すなわち必ずリン酸化されているタンパク）そうでないとどこで失敗したかわからなくなりますからね。

お礼

ありがとうございます。いろいろ改善すべき点がみえてきました。再度チャレンジしてみます。

回答No.3

TCA

以前にリン酸化蛋白の検出をしたときに使っていたlysis buffer には、可溶化剤としてNP-40とデオキシコール酸ナトリウムが入っていました。他にNaF、EGTAが入っていて、使用時にプロテアーゼ阻害剤を何種類かと、NaVO4、DTTを添加していました。申し訳ありませんが濃度は覚えていません。
蛋白の抽出液は凍結融解を繰り返さないようにするため、一回に使う量ずつに分注して凍結保存し、一度融かしたものは再利用しないようにしていました。
ウェスタンのブロッキングには先輩の薦めで脂肪酸フリーのBSAを使っていました。

お礼

回答ありがとうございます。参考にさせて頂きます。

回答No.1

fujishiro

どんなタンパクのどんなリン酸化を検出したいのかわかりませんが、一般的にリン酸化タンパクをキレイに検出できるかは、サンプリングの方法と、抗体の良し悪しにかかっています。
まぁタンパクを免沈後にリン酸化抗体を当てるのか、それともまんまウエスタンなのかによっても変わりますけどね。

「ポジコンのリン酸化タンパク」が検出できますか？

検出できないなら検出方法に問題（抗体が悪いか、抗体とブロッキング液の組み合わせが悪いか、単純に検出感度が低いとか）です。

「ポジコンのリン酸化タンパク」が検出できるならサンプリング方法が悪いか、サンプルが本当にリン酸化されていないかです。

お礼

回答ありがとうございます。具体的にはMφのLPS刺激系のMAPKの経路の蛋白をターゲットにしてます。ポシコンの蛋白とはリン酸化される前の蛋白のことでした。方法はブロッティングしたメンブレンに直接抗体を当てる方法です。この場合抽出時のlysis buferにphosphatase　inhibitorを添加すべきでしょうか。サンプリングの留意点ありましたら教えてください。また泳動前にサンプルをボイルすべきでしょうか。重ねがさねの質問ですみませんが宜しくお願いします。