SDS-PAGE

質問

麹菌の培養液中のアミラーゼタンパクを確認するためにSDS-PAGEを行っています。
マーカーやBSAはしっかりと見えるのですが、サンプルだけどうしてもバンドが出ません。培地中の成分が阻害しているのかと思い、透析を行っても見ましたが、やはり何も確認できませんでした。うっすらとスメアの何かは見えますが、バンドは見えません。サンプルのタンパク量は10～100μlに調節しています。何が原因なのでしょうか・・・。お手数ですが宜しくお願いします。

回答No.3

TCA · ベストアンサー

全てのサンプルが泳動されず一部スメアになっているということでしたので、泳動サンプル中の蛋白質が十分変性していないのかもしれません。サンプルを泳動前に処理した時の温度や時間、SDSやメルカプトエタノールの濃度は問題ないでしょうか。また、サンプルが酸性ですとうまく泳動できないと思います。培養液が酸性ということはないでしょうか。

お礼

回答ありがとうございます。
私もサンプルの変性がうまくいっていないと思います。
サンプルはpH7～8でした。
もう一度サンプル調整を再検討してみます・・・

補足

サンプルバッファーを調整し直したところ、無事解決しました。
メルカプトの代わりにDTTを使っていたのですが、古いDTTが酸化してしまっていたため、タンパク変性がうまくいってなかったようです。ご指摘有難うございました。

回答No.4

TCA

SDS-PAGEの際、高濃度の界面活性剤が妨害する事例を見たことがあるので、何らかの夾雑物が泳動を妨害している可能性は０ではないと思います。サンプル中の水溶性夾雑物を除去する方法として、TCAで蛋白質を酸不溶性沈殿として回収する方法（TCA沈殿）があります。TCA沈殿は再溶解する時の溶媒量を減らすことにより、サンプル中の蛋白質濃度を上げることもできます。

お礼

サンプルバッファー中のDTTの酸化が問題だったようです。
DTTを新しくしたところ、TCAでもバンドが確認できました。
有難うございました。

回答No.2

ramp1

量が少なすぎるのではないでしょうか？

蛋白定量はなさいましたか？

必要なら，銀染色などしてみたらいかがでしょう？

お礼

サンプルのタンパク量は10～100μg（1～10mg/ml）で段階的に変えて流してみましたがほとんど変わりませんでした。タンパク量の問題ではなく、PAGEでサンプルが流れていないと思うのですが・・・

回答No.1

TCA

アミラーゼに糖鎖が付加されていたりしませんでしょうか。糖鎖の大きさによって分子量にばらつきが生じ、精製された蛋白質でもバンドがスメアになることがあります。

参考URL：

http://www.j-oil.com/finechem/html/sugar_detection/enzep.html

お礼

回答ありがとうございます。
説明不足で申し訳ありません。
麹菌の培養液をそのまま流しましたので、アミラーゼだけではなく麹菌のクルードタンパクが確認できるはずでした。スメアなバンドも本当にうっすらで、肉眼ではほとんど見えないといってもいいかもしれません。タンパク量と活性（アミラーゼ活性）は確認できているので、PAGE自体がうまくいってないとは思うのですが、何が原因なのかわかりません。