腱のホモジネート方法

質問

腱から核内のタンパク量（ELISAによって）を測ろうとしています。
Kitを使って組織→細胞→核内物質に分けようとしていますが、ホモジネート法がよくわかりません。
マニュアルには、組織は凍結しないほうがよいと書いてあるのですが、私のいるラボでは、凍結してホモジネートする方法しか知っている人がいないのです。
最初に考えていたのは、組織を小さい切片にしたのち、エッペンに入れその中に錘をいれて振ってホモジネートする方法です。
凍結しないままではうまくいかないという意見が多いのですが、この方法で行っている方がいらっしゃったら教えてください。
また、その他、こういう方法が良いという意見もありましたら教えていただけると幸いです。

回答No.1

noname#160718 · ベストアンサー

昔、鳥の脚の腱からウイルスを分離した時に、腱のホモジナイズをやりました。
　腱はたいへん厄介です。

　１つはビーズショックをかける方法で、2mlのチューブ(平底でスクリューキャップのもの)に検体(腱)と1～2mmのジルコニアビーズを入れ、ビーズショッカーで激しく振る、というやり方です。
　工夫次第でいろいろバリエーションがあるのですが、検体とビーズの他にバッファ(PBSや生理食塩水)を入れ、チューブを満たしてビーズショックするやり方が、処理が終わるとそのままホモジネートになっているので楽です。

　ただしこのやり方だと相当激しく振らないとホモジナイズできません。うちは安井機械のマルチビーズショッカーを使っているのですが、腱のような堅い組織だと4,000rpmで５分振っても綺麗なホモジネートにはなりませんでした。
　第一、4,000rpmで５分も振ったら熱が上がってウイルスが不活化してしまうのでダメでした。

　で、次に試したのが4,000rpmで１分振り、一旦チューブを取り出して氷に漬け、冷やしてから再度１分・・・を延々と繰り返す、という方法でしたが、検体数が多いとあまりに面倒なのでこれもダメ。

　次に試したのは、チューブに検体とビーズを入れた状態で-80℃で凍結し、フリーザーから取り出したら速効でビーズショッカーにかける、という方法。この場合、バッファは入れません。
　これがけっこう粉々になってくれて具合が良かった。
　これも回転数と時間によって熱が上がるので、最終的に2,000rpmで1
～2分という条件に落ち着きました。

　この方法、肝臓や脾臓などの普通の臓器では非常に具合が良かったです。けっこう綺麗なホモジネートになってくれるしウイルスの失活もほとんどなかったし。
　でも・・・腱はやっぱりそれでも辛いです。
　チューブの径とビーズの大きさ(私が試した中では2mm径のビーズが最も具合が良かった)と量、それから検体組織の大きさと形までもが、ホモジネートのデキに関わってきます(やや薄目の長方形の板状に切り出した時が最も綺麗なホモジネートができました)。根気よく最適条件を見つけるしかないですね。

　他には超音波ホモジナイザーがあれば試してみても良いかもしれません。あまり期待できそうにないですが・・・
　それから回転シャフト式のホモジナイザーもあります。これも腱だと一緒に回ってしまってさっぱりホモジナイズできないくせに熱だけは上がるので、私は諦めましたが。でも工夫次第で上手く使える方法があるかもしれません。

　ま、基本に帰って乳鉢とスリコギでゴリゴリやる・・・というのが最もベーシックな方法なのですが、腱が相手だとかなり絶望的な闘いを強いられます。

　今思いついたのですが、どうせ凍らせるなら-80℃より液体窒素の方が断然良さそうですね。ビーズショッカーにかけるといかにも景気よく砕けてくれそうです。

　「凍らせてはダメ」という理由は確認した方が良いです。理由によっては質問者さんがやろうとしている実験系には影響がないかもしれませんから。凍らせずにロクにホモジナイズできないより、ロスがあってもトータルでは凍らせた方が有利、という場合もあるでしょうし。
　やろうとしている実験系によって事情はそれぞれですので、自分の実験系全体を通して、何がどこにどう影響するのかを整理する必要はあるでしょう。

　いずれにしろ、腱に限らず臓器や組織をホモジナイズする時は、その臓器を覆う「膜」類は事前処理で徹底的に除去しないと上手くいきません。筋膜とか硬膜とか軟膜とかその他諸々の「膜」です。
　この膜だけは、例え10,000rpmで１時間くらいビーズショッカーにかけても「膜」のままでしょう。なので検体にこの手の膜が残っていると何しても上手くホモジナイズできません。

　ちなみに、「ホモジナイズする」が正しい用語で、ホモジネートはホモジナイズした結果の乳剤のことだと認識しているのですが？

お礼

やはり、核内物質を定量するためにはちゃんとホモジナイザーを使わないとダメなようです。
ありがとうございました。