Lowry方のタンパク定量について教えてください。

質問

現在、Lowry法によるBSAのタンパク定量(スタンダード)を行っているのですが、サンプルでは、細胞を溶かすのにNaOHを添加するため、スタンダードのBSAにもNaOHを添加しています。しかし、1N以上のNaOHを添加すると、その後の操作のフォリン添加・インキュベーション後に白濁していました。1N以上のNaOHを入れると、白濁することってあるのでしょうか。それとも自分の実験ミスでしょうか。お答えいただけると幸いです。

回答No.2

teru-arai · ベストアンサー

通常の Lowry法の場合、まずサンプルを0.1M NaOH中でインキューベートし
銅イオンをタンパク質に結合させます。それから、Folin試薬を加え、青色を発色
させます。青色の発色はpH11ぐらいの時が一番良いそうです。
　Folin試薬に2Nと記載されていると思いますが、この2NというのはFolin試薬
中の塩酸の濃度を表しています。計算してもらうとわかりますが、サンプル溶液中の
NaOHとちょうど中和する量の塩酸を加えています。サンプル中には他にNa2CO3
が溶けています。NaOHが塩酸で中和されるとNa2CO3の緩衝作用が出てきて、
pH11程度の青色発色に良い条件となるように“しくまれて”います。
　記載されていることだけでは、どのくらいのNaOHが入ったのか良くわかりませ
んが、Na2CO3の緩衝作用が間に合わなくなるほどのNaOHを入れたら発色がそも
そも悪くなるでしょう。それから、白い沈殿は銅イオンの水酸化物と思います。NaOH
溶液中で有るにもかかわらず銅イオンが沈殿しないのは、酒石酸が銅イオンをキレート
しているためですが、長時間は持ちません。おいておくと少し青みがかった沈殿を生
じます。NaOHが中和しきれなかったため、生じた銅の水酸化物だと思います。
　Lowry方の妨害物質にNaOHについての記載はないですね（タンパク質の定量法(菅
原潔他、学会出版センター)）。＃１のかたが参考にあげたBioRadのLowry法は沈殿さ
せるやり方で、通常の方法ではないです。

お礼

なるほど、銅イオンなのですね、助かりました。ありがとうございます。
それと、あともう一つ問題があるのですが、NaOHを入れていないBSAのタンパク定量の値が発色が足りないのはなぜでしょうか。以前は、1.5倍ぐらい発色したのですが、最近になって発色しなくなりました。
C-solutionはいつもプレートに添加する直前でsolutionB1、2、Aの順で混合して使っています。そもそものBSAに問題があるのでしょうか。

回答No.1

sevenless

1N の NaOH は多いような気がします。
BioRad の Lowry 法キットでは、共存可能試薬として 0.5M NaOH となっていました。

お礼

ご回答ありがとうございます。そうですか、やはり1Nは多いですよね。では、この白濁は何なのでしょうか。多いと起こるのでしょうか。