エクソンの欠損が片方だけ（ヘテロ）。確かめる実験？

質問

初歩的な質問ですみません。ある遺伝子のあるエクソンが、片方だけ（ヘテロ）欠損しているかどうかを確かめるのは、どういう実験をすればよいでしょうか？

DNAシーケンスしても、もう一方は正常なので、欠損が読み取れないと思うのですが、どうすればよいでしょうか。

知識のある方、ご回答お願いします。

回答No.3

negigi · ベストアンサー

やりたいことがよく分からない。Splicing variantをみたいの？だったら、目的のcDNAの全長を読むのが一般的じゃないのか。
欠損箇所が分かっててExonがゴソっと抜けてるなら、逆転写産物に対して、前後のExonからPCRすりゃわかりそうだけど。ヘテロなら2本バンドになるでしょ。Sequenceなら前後のExonにprimerを設計したら、欠損部分で読み取りがずれて、2つのピークが重なったようになるはず。それでも評価はできるし、やってる論文も見たことはある（ゲノム上のものだったけど）。
同僚は、ゲノム上の1塩基レベルの変異については、Taqman法で見てる。変異ありのTaqman probeと変異なしのTaqman probeでRT-PCRしてるけど、データはかなりはっきりと出るよ。primerの設計によっては、通常のPCRでも判別つく（今スグは出ないけど、以前に論文で見たことはある）みたいだけど、同僚曰く、結構難しいらしい。

回答No.2

larme001

シーケンスをしたいのであれば、外側ではさんで増幅させてからゲルでそれぞれのバンドをきりだしてシーケンスに持ち込めばよいでしょう。

　どの程度キチンと確認しなくてはいけないのかとかにもよるとおもいますけど、簡単な方法だったら
DNAをとってきてからたとえばエクソンの配列がわかっているならエクソン内部のRと外側のFのプライマーを用意して外側からFを用意して全て混ぜてPCRをすれば、ヘテロであれば先のそれぞれのプライマー同士での組合わせで3つバンドができるでしょう。できればネガコンでホモ欠損あるいはWTのものもあるとよいとは思いますけどまあ無くてもわかると思います。というか、極端な話外側だけでPCRをかけるとかでもいいわけですよね。

　あるいは制限酵素を組み合わせて調べるとか古典的な方法でしょうか？

　もう少し極端にというならエキソンーエキソンジャンクションにうまくかぶるように設計してそれぞれでの増えるかどうかで判断するとかもありでしょう。

　いずれの場合もできればネガコン（どちらも欠損またはどちらも含む）のDNAサンプルがないと本当にうまくいっているのか（primerが機能しているのか）という疑問が少しの残りますけど

　PCRよりももう少し本当に1:1で存在していることをきちんとやるならサザンとかFISHとかで配列特異的に検出する方が確かでしょう。少し状況は異なるかもしれませんが多分昔のノックアウトマウスのじぇのタイピングなんかの方法が参考になるかと思います。

　まあ結局のところ、自分が納得したところでそれが目的として一般的に認められていないなら意味がないわけなので、何を証明したいのかというところからそレと同じような目的で使われているオーソドックスな方法でやるのがいいでしょう。例えばそういう遺伝子を新しく見つけたという論文が書きたいならどんなに確からしい方法だと自分が行っても投函するジャーナルのレフリーが納得しないといけないわけで、それならまずは類似の論文で（できれば同程度のジャーナルに出されたできるだけ新しいもの）使われている方法を用いるのがいいのではないかと思います。間接的に言おうとすれば何とでもなるのですが、きちんとやろうとすればそれはそれで結構面倒だと思いますからね。

お礼

大変丁寧な回答、ありがとうございまいた。

回答No.1

unaplasm

私はそういった解析を行ったことはないためあくまでも参考に。

欠損箇所がわかっているのであればその領域をターゲットにしてリアルタイムPCRを行い、
ゲノムDNA中の標的配列の量を定量できると思います。
ただ、ゲノム中にホモログ等がある場合は単純な比(非欠損個体と比較して2:1とか1:1とか)にならないためご注意ください。

お礼

丁寧な回答、ありがとうございまいた。