インサートの向き、入りやすさ

質問

平滑末端のライゲーションを行うとき、
インサートの向きがあると思いますが、確率はどちらとも1/2なんですか？
立体構造、塩基配列により多少は変わってくるものなんですか？

また、インサートが小さいほど入りやすいんですか？
これは比例的と考えてよろしいでしょうか？

また、付着末端の場合は向きは調べなくてもいいんですか？
調べなくてもよいなら効率が悪い平滑末端のライゲーションは
あまりしないということになりますが。

回答No.4

masama2006 · ベストアンサー

>コンストラクトは慣れない内は難しいですよね。
ライゲーションは難しいですよね。
本当にそうですね。苦労します。

>脱リン酸化、モル比が重要なんですよね？
その通りです。
ただ、モル比に関してはかなり大雑把にやっている人が多いかも知れません。私はフラグメントを大過剰に入れたこともあります。

セルフライゲーションしたベクターばかりがとれてくるのではないでしょうか？どのようなコンストラクトを考えていて、どんな手順でされていますか？

ひとつ、失敗を無駄にしないコツを。それは「コントロール」です。
ライゲーション反応をするときに、別にコントロールを用意できませんか？
例えば脱りん酸化したベクターだけをライゲーションしてみる。
一杯コロニーが出たら、脱りん酸化が原因。
これならば絶対にうまくいくはずというものをライゲーションしてみる。（誰かが以前成功したことのあるものなど。）
付着末端もこの際。
もしうまくいかなければライゲーションの酵素がダメになっているなどの考察もでき、次に生かせます。
自分の腕は悪くないという証拠を示せるようなものがあるといいですね。
コントロールはどんな実験でも大事。いや、もうご存じですね。

もうひとつ、気持ちが煮詰まらないコツも。
今こちらでされているように、誰かに沢山相談することが大事だと感じます。できれば、実験ノートを見てもらえるような身近な人。

コンストラクトがうまくいかないと辛いですよね。
お察しします。頑張ってくださいね。

お礼

コンストラクトはうまくいかなかったときもあります。
シークエンスの解析がめんどくさいですね。

ライゲーションのモル比って重要なんですか？
基本的にセルフライゲーションを防ぐために
インサートを多めに入れるのがコツみたいですが。

インサートが二つ入ったりすることはないんでしょうか？
私は入ったことがありますが。

脱リン酸化酵素ってそこまで効きが悪いんですか？
ちゃんと処理をしてもセルフが出ますが。

回答No.8

masama2006

＞研究所って労働時間が長くないですか？
当研究所は人によって色々。
定時に帰る人アリ、
夜中まで残る者アリ。
仕事内容や家庭の事情で違います。

＞趣味でやっている人が多いんでしょうか？
好きでやっている人が多いと思います。
特にテクニシャンならば好きでやっている人意外は続きません。
神経を使う割には、パーフェクトに出来て当然・知ってて当然の世界だからかも。　
知る範囲だと、５年以上続く人は多くはないです。

＞給料はいいんですか？
いえ、いいとは思いません。

そちらはいかがですか？

おっと、最初のご質問からは随分離れました。
また何かあったら別トピ立てて下さいね！
またお会いしましょう。

お礼

5年以上続く人はいないんですね。
初めて知りました。

回答No.7

masama2006

ハイ、そうです。
某研究所に勤める実験オタクのラボテクニシャンです。
時々顔を出しますので、よろしくお願いします。

お礼

研究所って労働時間が長くないですか？
趣味でやっている人が多いんでしょうか？
給料はいいんですか？

回答No.6

masama2006

＞コンストラクションはおかげさまでうまくいきそうです。
よかったですね！
何が原因だったんですか？

＞最近はライゲーションキット（TOPO）があるので楽なようですね。
インビトロジェンのTOPOシステムですか？これは早くて楽でいいですね！インサートは良く入りますし。しかし・・・私のラボで最近使い始めましたが、まだ慣れなくて。私の立てた別トピックス参照。
そちらのラボはTOPOシステムや青白選択ではない、
プレート上では区別はつかない手法ですか？
もしそうならば、かなり大変そうですね。

＞青白選択とかは便利なんですか？
ええ、便利です。こればかり使っていました。
TOPOシステムが出る前はこれを使っていたラボも多いと思います。
TOPOと比べて便利かといえば、どうかな？時間や手間がかかりますからね。TOPOは最近使い始めたところですから、なんとも言えません。
青白選択は、ブルーだったらベクターのみ、
ホワイトだったらインサートが入っている可能性が高いという風に、
分かりやすいのが利点。（ただ、たまにですが、ブルーコロニーでもブルーの色が薄い物はインサートがちゃんと入っている場合もアリで、ビミョーな部分も。）

＞1文字でも間違うといけないので大変です。
そうですよね、信頼に関わりますからね、大変です。
この業界、ノーミスは当たり前という前提もあり、どれだけ完璧にやれるかが能力として評価される事もアリで、キツイと感じることも。
１００点を目指すのは９９点を目指すのに比べて１０倍以上の神経をつかいますから。実験の一連は細かい作業、ラボにいる人間も大方細かくて。長年いますが、この気風に合わなくてやめていく子も多くいます・・

ご研究のご発展をお祈り申し上げます。
頑張って下さいね。

お礼

回答ありがとうございます。
はい、コロニーをひとつひとつ調べないと行けない方法です。
自作のベクターへのライゲーションなので
青白選択ができないと思います。
大変ですね。

TOPOはいつ頃出たのですか？青白選択はいまだメジャーな方法なんですね。

確かに生物系の仕事は失敗をしないのが当たり前というのがキツいですね。シークエンス確認、遺伝子中など結構細かい作業もありますので大変です。
気風に合わない人も結構いるんですね。
私も合っているか分からないですが。

masama2006は研究所にお勤めなんですか？

回答No.5

masama2006

＞ライゲーションのモル比って重要なんですか？
モル比って重要か？ということですが、
どの程度重要なのかは厳密には分かりません。モル比を少しずつ変えて効率を調べれば良いのでしょうが、やったことは無し。なぜなら、私は大雑把にしか考えていないからです。
たとえば、インサート０．５キロ～２キロ位+ベクター３キロの場合、モル計算無しで、同じナノグラム数で入れる。こんなんでもうまくいく場合が多いです。
モル比って重要ではないと断言できるほどの自信はありません。ただ、ホントに厳密にする必要はあるのかな？大きく外れなければ大丈夫ではないのか？と、密かに思っています。
いや、こんな事をいうと、ちゃんとやらなきゃダメ！と言われそうですが。

＞基本的にセルフライゲーションを防ぐために
インサートを多めに入れるのがコツみたいですが。
ハイ、それがコツだと思います。

＞インサートが二つ入ったりすることはないんでしょうか？
はい、二つ入ったりすることがあります。
数十ベースの短いフラグメントだと、それ以上入る場合も。
でも、二つ入ったものが取れても良いではありませんか。
インサートが一つ入ったまともな物が、ワンコロニーでも取れれば。
一つ入っているか、二つなのかは、
シークエンスやマッピングで区別できるので問題無し。

＞脱リン酸化酵素ってそこまで効きが悪いんですか？
ちゃんと処理をしてもセルフが出ますが。
私も必ずセルフが出ます。
セルフが一つも出ないような、完璧に脱リン酸化したベクターを作った経験はありません。
ただ、
脱リン酸化したベクターだけでのライゲーションと、フラグメント入りのライゲーションとで比較し、
ベクターのみよりもフラグメント入りの方がコロニーの数が多ければ、脱リン酸化は問題ないだろうと考えています。
（此に関しては例外アリ。２つとも同程度の数が出ても、もしくはフラグメント入りの方がコロニーの数が少なくても、うまくいっている場合もたまにあります。）　

確かにシークエンスは面倒ですね！　
でも、最近はすぐに結果が出るので楽になったと感じます。
以前は放射性同位元素を使用し、通電中にバッファーに触れたら高電圧で死ぬと言われた装置を使い、ある意味命がけでシークエンスをしました。
塩基配列も、自分の目でAGCC・・・とラダーを追いました。
いや、ホント、現在は楽ですよー　

平滑末端のライゲーションはうまくいきそうですか？
脱リン酸化したベクターだけでのライゲーションとの比較はされてみましたか？　
100ベース単位のインサートの挿入は電気泳動で確認できましたか？
ご検討をお祈りいたします。

お礼

コンストラクションはおかげさまでうまくいきそうです。
最近はライゲーションキット（TOPO）があるので楽なようですね。
青白選択とかは便利なんですか？

シークエンスはプライマーを複数使う物は解析が大変です。
昔と比べると楽なんでしょうけど。
1文字でも間違うといけないので大変です。
まあ、慣れなんでしょうけど。
Rのプライマーがあったりとややこしいです。
GENETYXというものを使っているんですが、
説明書がないのが困りますね。

回答No.3

masama2006

>つまりやってみないと分からないわけですね。
そうですね。

＞100ベース単位のインサートの挿入は電気泳動で確認できるんですか？
インサートの大きさによります。
例えばインサートが１００ベースと２００ベースだったら、その差は分かりますよ。１００ベースラダーというマーカーを使うのが一般的だと思います。
エチブロ染色で、これくらいの低分子量だと、アガロースゲルを使ってバンドをハッキリと写真に写るようにするのはちょっと大変かも？でも高濃度のアガロースゲルならば大丈夫かな。また、ゲルレッドという染色剤をアガロースゲルに入れておけば、１．２％ゲルでも１００ベース・２００ベースは綺麗に写ります。あとはアクリルアミドゲルだったらハッキリと区別できます。
例えば、５キロと５．１キロの差だったらどうかな。ゲル濃度によっては僅かに差が見えるかも知れませんが。
マーカーを変えればできるんでしょうか？

マップシークエンスとは何ですか？
マップ（制限酵素処理して目的の断片が得られるかを見ること。）とシークエンスです。シークエンスをやるんだったらマップはいらないかも。

＞TGとかを作るんだったら期間が長いのでシークエンスの確認、ここでは
向きですが、は重要ですよね。
そうですね！

＞付着末端ですとほとんど成功するんですか？
前述しましたが、付着末端であっても、入れるフラグメント（コンストラクト）によっては絶対に成功しないものも。卒研の頃、コンストラクトもできない馬鹿者と周りに言われて非常に悩みました。
私は現在、２回やってダメだったらコンストラクトをデザインし直します。時間は宝ですからね。

なにかうまくいかなくてお悩みでしょうか？

お礼

コンストラクトは慣れない内は難しいですよね。
ライゲーションは難しいですよね。

平滑末端のライゲーションがうまくいかなくて悩んでいました。
脱リン酸化、モル比が重要なんですよね？

回答No.2

masama2006

＞立体構造、塩基配列により多少は変わってくるものなんですか？
自分の経験だけから言うと、立体構造、塩基配列のせいでしょうか、
多少変わることもありました。極端な場合、全く正方向ばかりで逆は取れないということも。
＞インサートが小さいほど入りやすいんですか？
綺麗に比例のグラフが書けるかどうかは不明。
ただ、１００ベース前後のフラグメントは非常に良く入りました。
２ー３キロ位はまあまあ、５キロを超え、７キロまで行くと効率がかなり落ちました。ただ、入りやすいはずの短いのが全然入らないなんて事もアリ。そうですね、１００回やったら１回か２回くらいでしょうか。
＞付着末端の場合は向きは調べなくてもいいんですか？
平滑末端にしろ、そうでないにしろ、ライゲーションの後はマップ・シークエンスをやるべき。向きを調べるのは当然です。
反応液の中で何が起こっているのか分かりませんよ。半年後、実験の結果が出た後に、プラスミドがちょっと変だったと分かるのは非常に怖いですよー。私は若年の頃、１年を棒にふりました。
＞効率が悪い平滑末端のライゲーションは
あまりしない
確かに、平滑末端のライゲーションは嫌いです。効率が良くない時もアリですから。でも、普通にできますよ。

お礼

つまりやってみないと分からないわけですね。
100ベース単位のインサートの挿入は電気泳動で確認できるんですか？
マーカーを変えればできるんでしょうか？

マップシークエンスとは何ですか？
方向は制限酵素、シークエンスで確かめますが。

TGとかを作るんだったら期間が長いのでシークエンスの確認、ここでは
向きですが、は重要ですよね。

付着末端ですとほとんど成功するんですか？

回答No.1

Dr_Hyper

先日の回答の補足もかねて。
向きはインサートと大腸菌の相性でも左右されることがあります。経験的にですが、ある特定のインサートのある方向のものが何個ひろっても出てこないという場合があります。インサートの毒性などと表現されますが、定かではありません。それこそコロニーに違いが出てくるかもしれませんね。普通はインサートの向きは１/２の確率と考え良いと思います。

インサートが小さいほど入りやすいか。うーん。長いと入りにくいが一般に言われることだと思います。インサート自身が丸くなってligation されるなどと考えられていると思います。

５’突出、３'突出いろいろ酵素はありますが、インサートの両端を同じ酵素で処理し、ベクターに入れる場合には当然向きの確認はしなくてはいけませんよね。５’をBamHIで3'をEcoRIで処理してベクターもBamHIとEcoRIで処理してligationすればBamHI/EcoRIの向きでつながる訳ですから、mini-prep後でinsertがBamHI/EcoRIで処理してバンドとして検出されれば、向きは予想通りの向きで入っていたということになり、向きを調べなくてもいい。ということだと思います。

サブクローニングの際に平滑末端を使わなくても良い場合であれば、なるべく使用したくないものです。読み枠の関係や、都合のいい酵素サイトが無い場合、PCRでリンカーを付けずにサブクローニングする場合などどうしても使わないといけない場面があるのです。