PCR法に関しての質問です

質問

酵素反応の速度を支配する要因として、(1)濃度因子(基質濃度・酵素濃度・阻害剤や
活性化剤の濃度),(2)外的環境因子(pH・温度・圧力・溶媒など),(3)基質の分子構造,
(4)酵素の分子状態と存在状態(化学修飾・遺伝子的修飾・固定化など）がありますが、
これらの要因を制御した最適条件のもと、PCR法で利用される酵素反応を円滑に進めた
いとき、上記の要因をどのようにすれば、最適条件になるのか、最適条件の利用につ
いて教えてください。よろしくお願いします。

回答No.2

taketaketakeo

(1)最適な活性化剤（＝塩化マグネシウム）濃度は付属のbuffer中の含有量を見ればわかります。
　　酵素濃度もTaqの説明書に記載された濃度が最適濃度です。（もちろんさらに入れても速度は変わりません。
　　既に最大速度になっているはずなので無駄なのです）
　　阻害剤はもちろん０が最適です。
　　基質濃度は多くあればそれだけ反応速度は早くなりますが（もちろんどこかで頭打ちはする）100ulの系のとき10ng以下にしないと特異性が下がります（と本に書いてました）
（２）PHも付属のbufferのＰＨが最適。
　　　温度はTaqの説明書に書いてあるものが最適(たいがい72℃）
　　　圧力は１atm以外考えなくてもいいと思う。圧力で変わるとしてもどうしようもない。
　　　溶媒はbufferを1/10にしたらそれが最適（組成は説明書に記載）
（３）基質の分子構造・・・DNA二重らせん。DNA結合タンパクが付着していてらせん構造が変わってる場合うまく酵素は働かないけどそれは構造の問題ではなくてタンパクが邪魔をするだけ。
（４）よくわかりません。

結局Taqを買ったときについてくる説明書を見れば、そのTaqの最適条件は全て記載されています。

sa ke no miさんの言うとおり上記に記載された条件はメーカーがきっちりしてくれてるのであとはTemplete　DNAの状態、primerの良し悪し、反応条件（アニーリング温度）、Taqの性能によって結果が左右されるでしょう。

回答No.1

noname#4684

ＰＣＲは、簡単です。難しいことを考えずに、ただ混ぜて、サーマルサイクラーにかければいいだけです。

上に記載された４ヶの要因は、ＰＣＲにおいては重要ではありません。この４ヶよりも、プライマーの特異性（いい部分をプライマーとして用いているか）が、成功・失敗を大きく左右します。