ゲノムDNAの定量について（PCRを使用せずに）

質問

組織の細胞数を数えるために、ゲノムDNAの定量をしようと思っています。
私の中では、real time PCRをして、そのGAPDHで定量をしたらよい、と思っていたのですが、えらい先生から、「それでも良いが、PCRせずにカウントしたらよいだろ？」と言われました。
当然のごとく簡単に言われたので、メジャーな測定方法なのだと思い、聞き返さなかったのですが、その後いろいろ調べてみるものの、その方法はどういったものがあるのかよくわかりません。吸光度を使用したことも以前あった気がしますが、かなりラフな測定だったと思います。
どなたかご存知の方おられないでしょうか？

回答No.3

noname#91223 · ベストアンサー

吸光度測定が最初に思い浮かびます。吸光度は適性範囲の濃度のＤＮＡに対してはかなり正確なのではないでしょうか。例えば市販のプライマーやプラスミド等の核酸の濃度は製造後に吸光度をもとに決定されていますよね。

むしろ今回の場合、リアルタイムＰＣＲの定量性ってどうなんでしょう。ＧＡＰＤＨ等のｍＲＮＡの量比は、細胞のサイズが大きく異なる場合に、どれだけ細胞数の比を反映するか疑問を感じますし、そうでなければゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲということになりますが、ｍＲＮＡと比べて遺伝子はコピー数が少ないですし、specificityのコントロールもシビアですよね。

「PCRせずにカウントしたらよいだろ？」というのを拝見すると、（ＤＮＡを「カウントする」という表現はあまり使わないので）やはり「細胞を直接見ながらカウントしたら？」といういう意味だったのでは・・という気がしないでもないですが。

以上、専門外ですのでほんの参考程度にお願いします。

お礼

ご返答ありがとうございます。
吸光度は、DNAの濃度測定にはやはり有用ですよね。
「PCRせずにカウントしたらよいだろ？」というのは、英語で言われたので意訳ですが、You should count amount of genome DNA, and don't need to do PCR. ということです。意味の取り方に問題があるのでしょうか？

回答No.2

noname#87716

細胞浮遊液であれば、血液（赤血球・白血球）のカウント法を応用できます。
http://rinsh.blog118.fc2.com/blog-entry-6.html

お礼

早々のご返答ありがとうございます。返信をしたつもりでしたが、うまくUploadしておりませんで、失礼いたしました。
1番の方にもお書きしたのですが、Collagenaseで組織をDigestして細胞をヘモサイトメーターでカウントしているのですが（トリパンブルーも使用して）、時間ととも（数週間の単位です）に細胞の数が増える予想に反して数が減っています。
たまたま2日前に他のサンプルでreal time PCRしたのですが、GAPDHを基準に半定量するとDNAとしては数が多くなっているようです。
このそう反する結果からも、gDNAの定量をして、死んだ細胞以外の細胞を測れないかと思っている次第です。

回答No.1

パんだ パンだ（@Josquin）

カウントって、顕微鏡で覗いて数えることでは？

お礼

早々のご返答ありがとうございます。
実はCollagenaseで組織をDigestして細胞をヘモサイトメーターでカウントしているのですが（トリパンブルーも使用して）、時間ととも（数週間の単位です）に細胞の数が増える予想に反して数が減っているため、そのエラーを疑われています。
確かに、数週間すると大きさは非常に小さくなるにも関わらず、組織サンプルのHE染色では非常に細胞が密になっています。そのためか、時間とともにDigestがしにくいのは事実なので、組織が細胞になっていないのかも知れないので、gDNAのカウントをして・・・、という流れです。
いかがでしょうか？