吸光度を用いたDNA濃度定量法について

質問

DNA溶液のAbs=260nm、280nm、320nmの波長を測定し、DNAの濃度定量を行ったですが、Abs260/Abs280の値が1.7より低く、DNAの純度があまり高くありませんでした。この場合、従来の吸光度計算（Abs260の値×50 ug/ml×希釈倍率）で精度の高いDNA濃度計算結果が得られるのでしょうか?　DNA純度が低い場合の吸光度でのDNA濃度定量法があれば教えてください!!

回答No.3

MIYD

>PCRによって増幅した約700bpのDNA断片
PCR産物であれば、残ったdNTPやプライマーなどがあるので、吸光度では全く定量性がありません。
カラム精製すれば、大分ましになるでしょうけれども、目的外のバンドがあった場合にはそれも測定してしまいます。
(アガロースゲルではシングルバンドでも、PAGEで見ると非特異なバンドが多数見えることがあります)

濃度の簡単な定量法は、濃度が既知の適当なマーカー(λ/HindIIIなど)をいっしょに流し、そのバンドの濃さから見る方法です。
もし、バンドの濃さがマーカーの濃さの範囲から外れるようであれは、希釈系列を作って見ます。

コダックのソフトというのがバンドのintensityを測ることが出来るのか分かりません。
例えば、画像として保存して,NIH Imageで定量することが出来ます。
ただ、今回のような目的であれば、目で見てどのバンドと同じ濃さなのかを見たほうが早いし、その精度で十分なはずです。

>僕の研究室のプロトコール
実験の目的は、そのDNA断片がライゲーションされたベクターを作ることですか？
それとも、研究室のプロトコール通りの操作をすること自体が目的なのですか？
役に立たないプロトコルに従っていると、無駄な実験をすることになりますよ。

100ng分位をアガロースゲルで流して切り出し(収率50%で50ng)
↓
制限酵素処理してもう一度切り出し(収率50%で25ng)
↓
ライゲーション
で、例えば1ng分のインサートがライゲーションされて5ng分位のベクターが出来れば、普通にトランスフォーメーション(10^8cfu/ug)すれば理論上は10万個以上のコロニーが取れます。
ライゲーションされたのが1pg分であっても、100個以上のコロニーが取れます。

5ugを用意するのであれば、PCRを50ul分もすれば増やせるでしょうけれども、
こんなたくさんのDNAをきれいに電気泳動するためには幅の広いコームのゲルを用意しないといけませんし、回収の手間も試薬代もかかります。

お礼

吸光度で測定する場合に、プライマーやdNTPの存在は無視していました。吸光度でPCR後のDNA断片を定量することは相当DNAの純度が高くないと難しいということですね。あと、ライゲーションに関してはPCRで増幅したDNA断片がライゲーションされたプラスミドを作ろうとしています。ライゲーション方法に関してのアドバイスも参考になりました。ありがとうございました。

回答No.2

noname#246619

No.1の方のおっしゃる通りで何を測ろうとしているのか不明なので回答はできませんがその他アドバイスを書きます。

不明なものが混入しているサンプルで精度の高い定量ができるわけがない。
→再度、精製して再測定すればよい。
塩基組成の偏りでAbs260/Abs280の値がそう見えているだけのこともある。
→３点測定しただけでは何が起きているか判別できない。220-320nmのスペクトルを測定するとその形状から判断できることがある。

そもそも精度の高い定量が必要な実験なのか？
→実験の内容によって気にする必要がないかもしれない。むしろ純度が低いことが問題になるかもしれないが。

お礼

返答が遅れてすいません。実際に吸光度を測定したサンプルはPCRによって増幅した約700bpのDNA断片です。このDNA断片は今後制限酵素処理し、その後インサートとしてベクターとのライゲーションに用います。なのでDNA量が多い方がいいです。僕の研究室のプロトコールではDNA量は具体的には5μg分ないと制限酵素処理に使えません。

回答No.1

MIYD

プラスミドやゲノムDNAを測定しようとしているのでしょうか？
そもそも吸光度はモノマーのDNAでも検出していますので、精度は低いです。
目的のDNAを測定したいのであれば、電気泳動をして見るのが一番簡単です。

お礼

返答が遅れてすいません。実際に吸光度を測定したサンプルはPCRによって増幅した約700bpのDNA断片です。電気泳動で目的のDNA断片が得られたことを確認できるのですが、その場合定量はどういうふうに行いますか？僕はMacのコダックというソフトを使用しています。