2 step PCR

質問

2stepPCRの概要やプロトコルを教えてください。メリットは特異性を上げる、時間短縮ということでよいのでしょうか。PCRをしているのですが、バンドが複数出てしまうので、2stepPCRを考えています。プライマーのTm値は64℃です。2stepPCRにはもっとTm値の高いプライマーが必要でしょうか。よろしくお願いします。

回答No.1

CTAB

2ステップPCRはシャトルPCRとも呼ばれますね。これは基本的に長いプライマーを用いる場合に行います。（Tmが70前後でプライマー長が30を超えるくらいのときですね）
　時間は短縮されますし特異性もあがりますが、もし通常のPCRで複数バンドが出ていて、そのときと同様のプライマーを用いるなら、それは3ステップPCRのアニーリングを上げるのとあまり代わりがありません。特異性を上げたいならプライマーや条件を検討した方がいいと思います。

　あと既に考察されていて蛇足になるかもしれませんが、質問では特異性を上げたいとのことですよね。シャトルPCRではなくタッチダウンPCRのほうがいいと思います。特異性を挙げるPCRの手法としてはこっちの方がメジャーだと思います。

補足

わかりやすく説明して下さりありがとうございます。
タッチダウンPCRはずっと気になっていたのですが、プロトコルなどの詳細がわからず、まだ試しておりません。
最初のアニーリング温度をプライマーのTm値より高く設定するとどこかで読んだのですが、プライマーのTmが６７℃の場合、どのように温度を変えていったらよいのでしょうか。