組み換えDNA実験について質問があります。

質問

組み換えDNA実験について質問があります。
一種類のプラスミドと一種類の挿入DNA断片から、二種類の組み換えプラスミドが生じてしまいました。これはなぜでしょうか。

生物実験初めてなのでよく分からないのですが、お願いします！

回答No.6

otx · ベストアンサー

EcoRIの切り口はどうなっているか確認してください。

同じ配列はライゲーションによって結合しますので、
それから考えると以下のようになるとわかりますでしょうか？

EcoRIを（E）で表しますと、

可能性その１
＝プラスミド＝(E)ー挿入DNAー(E)＝プラスミド＝

可能性その２
＝プラスミド＝(E)ーAND入挿ー(E)＝プラスミド＝

可能性その３
＝プラスミド＝(E)ー挿入DNAー(E)ー挿入DNAー(E)＝プラスミド＝

可能性その４
＝プラスミド＝(E)ーAND入挿ー(E)ーAND入挿ー(E)＝プラスミド＝

可能性その５
＝プラスミド＝(E)ー挿入DNAー(E)ーAND入挿ー(E)＝プラスミド＝

可能性その６
＝プラスミド＝(E)ーAND入挿ー(E)ー挿入DNAー(E)＝プラスミド＝

さらに、可能性３、４、５、６に関しては挿入DNAの数でいくらでも組み合わせがありますし、あり得ます。

お礼

とても有益なご回答ありがとうございます!
早速考えられる可能性を調べてみます!

回答No.9

pluto39

アルカリ性ホスファターゼ処理をしなかったということはありませんか？
プラスミド同士が連結していることはありませんか？

お礼

ご回答ありがとうございます。
アルカリホスファターゼでの処理は行ったおらず、プラスミドが2種類生じてしまいました。

回答No.8

pluto39

利用したプラスミドは、pUC系ですか？

お礼

はいそうです、pUC系です。

回答No.7

otx

補足します、

他の可能性として

可能性その７
＝プラスミド＝(E)＝プラスミド＝

というのもあり得ます。
これにもプラスミドの数はいくらでもあり得ますし、そこに挿入DNAが絡んでくればいくらでも理論上あり得ます。

ふつうはシーケンスや電気泳動で得られたDNAがどのようなものなのか確認します。

回答No.5

photobac

切り口は,同じ制限酵素なのですか？

可能性は低いですが,インサートが二つ入ったとかは。。。

それぞれのｂｐがあるともっとわかりやすいかも。。。

お礼

ご返信ありがとうございます。
はい、切り口は同じ制限酵素でEcoRIです。
挿入DNA断片は800bpです。

回答No.4

otx

＞二種類とも、導入した同じ異種DNA断片が挿入された組み換えプラスミドです。

申し訳ありません。どういう作業をして、どういう結果が出たので、こういう風な２種類ができたと思われる。
ということを聞いてみたつもりでした。

＞一種類のプラスミドと一種類の挿入DNA断片から、二種類の組み換えプラスミドが生じてしまいました。

可能性から考えると、１種類のプラスミドと１種類の挿入DNA断片を混ぜた場合、２種類以上のプラスミドＤＮＡができる可能性があります。
何が起きたのかもう少し詳しく書いていただかないと回答が多岐にわたるのです。

お礼

はい、情報不足ですみません!
1500bpほどのプラスミドに800bpの異種DNA断片をプラスミドのEcoRI切断部位で挿入したところ、EcoRIの切断部位の同じ部位に2種類の組み換えプラスミドが出来てしまいました。同じ部位に同じ異種DNA断片が挿入されてしまいましたが、異なる組み換えプラスミドだと分かったということです。

回答No.3

biobiobio1

同じ異種DNA断片が挿入された組み換えプラスミドとのことですが、電気泳動の結果確認できた２つのバンドと目的のインサートが入っていたと理解すればいいですか？

もし、ベクターに目的のDNA断片が入ったものが1種類であったとしても、そのプラスミドの状態によってはバンドが３本以上になることもありますよ。

スーパーコイルやオープンサークル、クローズドサークルなど様々な形状が混じっている可能性は十分にありますからね。

お礼

はい、その通りです!
そうですね、DNAのスーパーコイルなども関係してきますね。
もう少し詳しく調べてみます。

回答No.2

linkslynx

DNA組み換えプラスミドとそのまま換わっていないプラスミド
ではないのでしょうか

お礼

ご回答ありがとうございます。
生成されたプラスミドですが、電気泳道の結果、二種類とも組み換えプラスミドだと分かりました。

回答No.1

otx

どう二種類なのでしょうか？

お礼

二種類とも、導入した同じ異種DNA断片が挿入された組み換えプラスミドです。