アニ－リングについて(専門知識は持っていません)

質問

ショットガン実験について調べていたのですが、
アニ－リングをする時に切断したＤＮＡ同士が再びくっつくことはあるのですか？
全てが上手いことにプラスミドＤＮＡ断片とくっつくとは思えないのですが…。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

まず、用語の訂正ですが、DNA断片同士を結合することは、ふつうライゲイション（ligation）といいます。この反応を触媒する酵素がライゲイス（リガーゼ、ligase）です。アニーリング（annealing）は、鋼鉄などを「焼き戻し」するというのが原意で、DNA二重鎖が熱で一本鎖に解離したものを、ゆっくり冷ますと、相補鎖がふたたび対合して二本鎖にもどる現象を意味しました。今では、広く相補鎖同士が対合することを意味します。ライゲイションのときもDNA断片の相補な突出末端で「アニーリング」するとも言えますが、ふつうそういう表現はしません。

さて、ご質問について。
これはショットガン法に限らず、クローニング一般についてですが、
＞ＤＮＡ同士が再びくっつくことはあるのですか
ありえます。そのためにふつう、DNA断片の分子数に対し、ベクターの分子数が過剰になるようにして、DNA断片同士が出会う確立より、ベクターと出会う確立の方が高くなるようにします。ベクター同士のライゲイションや、ベクター自身がライゲイションしてもとにもどる可能性も高くなりますが（self-ligation）、これを防ぐためにベクターの末端を酵素で脱リン酸しておきます（DNA鎖の5'末端にリン酸基がついていないもの同士だと、結合できません）。それでも、複数のDNA断片がキメラになってクローニングされることもまれではありません。

別の方法としては、逆にDNA断片の方を脱リン酸化して、それら同士が結合しないようにします。ベクターの方は脱リン酸する変わりに、２つのクローニングサイトを異なる制限酵素できって、self-ligationしないようにするとか、no insertのベクターがでは生えてこないような宿主／ベクター系をつかったりします。ほかにも、ベクターがもつinsertの長さの制限を利用して、複数のDNA断片が組み込まれると無効になるようにする、などなど、いろいろなトリックがあります。
ながくなりましたが、