ウェスタンブロッティング

質問

His-Tagを付けたセルラーゼ遺伝子の発現を見ています。ザイモグラフでは予想サイズの位置に活性が見られましたが、ウェスタンでシグナルがでません。抗セルラーゼの抗体に問題があるのかと思い、His-Tag抗体でも試しましたが、それでもシグナルは出ませんでした。理由が分かりません。活性はあってももしかしたらタンパクに修飾が起きているのか、と考えましたが、それでもＮ末をターゲットとした抗体とＣ末（His-Tag付加位置）をターゲットとしたもの両方でシグナルが出ないのもおかしいような気がします。ちなみにポジコンはシグナルが出ます。他に何か理由が考えられるでしょうか。

回答No.2

Dr_Hyper · ベストアンサー

活性があるのに、タンパクがwesternで検出できない。
タンパク質両端に対しての抗体でも検出できない。
westernのpositive controlはうまくいっているのでwesternには問題ない。
あなたがどのレベルの方かわからないので大変失礼になるかもしれないですが、一度SDS-PAGEを行った後、CBBまたはsilver stainingまたはRuby stainingのような蛍光試薬でもいいので全タンパク質を染色してみたらどうでしょうか？His-tagのタンパク質ということで一度は精製をされているのではないでしょうか？もしされていればそれで量的なものなど確認できますよね。
非常にまれですが、泳動は出来るけどtransferされにくいタンパク質があります。ただ程度問題で全然検出できないということは普通はないとおもいます。同様の意味でwesternでトラブったときはtransferした後のゲルを染色します。markerがprestainであればtransferに問題があればわかりますが、ここのタンパク質の転写効率は転写後のゲルを染色してみないと確実なことは言えません。
westernは通常上記にあげた染色法法よりも高感度ですので、上記の染色法でバンドが検出できるのにwesternが出来ないのであれば、量的なもんだいも含め抗体の使用方法など検討された方がいいと思いますが、前段階としてメンブレン上にタンパク質がちゃんとあるかは確認された方がいいと思います。

補足

ご返答ありがとうございます。
ここで言っているザイモグラフ及びウェスタンで使っているものは培養液の上清を濃縮したもので、精製していません。SDS-PAGEにはpre-stainのマーカーを使っていますので転写の確認はそれで行っています。また、ウェスタンを行うときはゲルの半分ずつをＣＢＢ染色用とウェスタン用に分けており、ＣＢＢで検出できるので、ウェスタンを行うには十分なタンパク量では、と考えていました。やはり転写後のゲルを染色して確認した方が良いのでしょうか。

回答No.1

sue_3

私の理解力不足なのでもう少し情報を教えてください。

タンパク量は十分とれてますか？（例えば、メンブレンがPonceau Sなんかで染まりますか？）

ポジコン（この場合Tagなしセルラーゼ発現タンパクですか？）が出ているならウェスタンブロッティングではなく、精製段階でなにかあるような気がします。セルラーゼはどのように採っているのでしょうか？

補足

ご返答ありがとうございます。
ここではザイモグラフも、ウェスタンも精製したタンパクを使わず、培養上清の濃縮したもので行っています。タンパク量はＣＢＢでそれほど濃くないけれども染まります。転写はpre-stainのマーカーで確認していました。