締切済み western blotting法について 2002/01/22 17:49 stacking gelとrunning gelでTris-HClのpHを変えるのはのはなぜですか？ おしえてください。 みんなの回答 （4） 専門家の回答 みんなの回答 code36 ベストアンサー率19% (25/129) 2002/01/23 11:23 回答No.4 ためしにと思って入れるトリスバッファーストックを両方6.8で 行ったら界面がでこぼこになりました。 よく考えると、ストックが8.8が1.5Ｍ、6.8が0.5Ｍなので 本当に反対にしているわけではなく、トリス濃度の影響かもしれませんが 界面をしっかりするという働きもあります 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 rei00 ベストアンサー率50% (1133/2260) 2002/01/23 10:30 回答No.3 rei00 です。 補足拝見しました。私も akiyamaharuka さんの意見に賛成ですので，ご自分で成書をご覧下さい。 と，補足要求しておいてこれでは何ですから，私の手元の成書（最新 電気泳動実験法，日本電気泳動学会 編集，医師薬出版株式会社）の記載を簡単に紹介しておきます。 【stacking gel に関して】 ・・・試料の pH が 6.8 からはずれると，電気泳動時の濃縮効果が悪くなり，バンドの幅が広がってしまい分解能は低下する。・・・ 【running gel に関して】 ・・・SDS-PAGE は，・・・・ポリペプチドが SDS と結合して分子量によらず一定の移動度をもつことを利用して分子量を測定する方法である。・・・ 詳細は akiyamaharuka さんもお書きの様に，ご自分で参考書などをご覧になって下さい。そうすれば，他の事も目に入りますので，多くの勉強ができます。皆そうやって知識を増やしてきたのですよ（akiyamaharuka さん，そうですよね）。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 noname#53364 2002/01/22 23:49 回答No.2 gelの名前がそのまま理由です。 電気泳動で分離するためには同時にスタートして、流れた距離で 分離をします。どうしてもゲルにアプライするときに高さ（スタート位置が ずれる）がでますのでスタッキングのあいだに濃縮（言葉ができとうかわかりませんが）して、同時にrunnning gelに流し込むわけです。 chargが変わるとなぜそうなるかは、岩波や化学同人の実験シリーズの 電気泳動やタンパクの本に必ずでていますので、参考に（大学の図書館ならまずあるはずです）。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 rei00 ベストアンサー率50% (1133/2260) 2002/01/22 18:37 回答No.1 少し質問がわかり難いですので，以下の点について補足いただきたいと思います。 ご質問になっているのは，western blotting でなく，電気泳動の事のように思いますが，よろしいでしょうか？もしそうだとしたら，どの様なタイプの電気泳動でしょうか？SDS-PAGE でしょうか？ stacking gel と running gel の Tris-HCl の pH を補足下さい。私の手元にある成書には，それぞれ 6.8 と 8.8 となっていますが，同じでしょうか？ 質問者 補足 2002/01/22 18:43 失礼しました。SDS-PAGEのことです。pHの値もおなじです。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学化学 関連するQ&A 5mM Tris-HCL(ph9.5)の作り方 5mM Tris-HCL(ph9.5)の作り方について教えてください。 5mMということは1L中に0.005molのtrisが含まれているということで合ってますか？ そうしたら、0.005molのtrisを1Lの水に溶かし、HCLでpHを合わせたらよいのでしょうか？ Bufferの作り方の疑問 1M Tris-HCl(pH8.0)などTrus bufferというのがよく出てきますが、 この作り方に関して質問があります。 例えば、1M Tris-HCl(pH8.0)を１L作る時、1molのTrisを測りとり、適当な量の水に溶かし、 HCｌをpH8.0になるよう加えていくかと思うのですが、 最終的に１Lにメスアップする際は水を加えるんですか？ そうしたら、pHがずれてしまわないのかなと思ったんですが・・。 また、１Mのものから0.2Mに希釈する時、水を加えて希釈するかと思うんですが、 例えば１MでpH８にしてあるものを水を加える事で変わってしまうのではないかと思いまして。 これらは、誤差の範囲と考えて良いのですか？ それとも、作り方が間違っているのでしょうか？ 超基本的なことかもしれませんが、 教えていただけますでしょうか。 宜しくお願い致します。 電気泳動の失敗原因 アクリルアミドゲルで電気泳動したのですが，ゲルをCBB染色して確認したところ，サンプルが泳動後すぐのところでかたまりになって流れていませんでした。その原因として考えられるのは何でしょうか。 アクリルアミドゲルは，running gelをアクリルアミド12.5%で作り，stacking gelを4%で作りました。単純に，ゲルが均一でなかったということなのでしょうか。 よろしくお願いいたします。 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた？ OKWAVE コラム ウエスタンブロッティングについて。 電気泳動して、ブロッティングして、抗体反応させて、いざバンドの検出をしたら、 １２０ｋＤに出るはずのバンドが、１００ｋＤに出てしまいました。 すごく濃く出ているバンドなので、その目的のバンドなんだと思いますが。。。 こういう現象って起こりますか？ またなにが原因なんでしょうか？ わかる方いましたら教えてください。 条件は、 ・Bis-Trisゲル。 ・ブロッティングはうまくいっています。 ・マーカーはAll Blue StandardとMagic Mark XP。ふたつのマーカーの位置を定規ではかってあわせるとほぼ同じ。 ・しかし、Magic Mark XPのバンドが見本以外の部分にもたくさん出て割れています。。。 ・二次抗体はanti-rabbitのもの。anti-mouseだとMagic Mark XPが割れることはない。 Tris-Hcl緩衝液について 酵素実験で、緩衝液としてTris－Hclを使用するのですが、 これはどのような仕組みでｐHの変化を弱めているのすか？ なるべく詳しく教えていただけるとありがたいです。 あと、Trisって何ですか？ 0.25M Tris-HCl(pH6.8)の作り方 0.25MTris-HCl（ｐH6.8）を200ｍｌ作ろうと思っています。 Trisは何グラム必要でしょうか？ また、pH6.8に合わせるために、0.01mol/LのHCｌを使おうと思っているのですが、 何L使用することになるでしょうか？ 自分でも計算してみたのですが、自信がないので質問しました。 よろしくお願いします。 NTAをTris-HClに溶かしたもののpH計算 NTAは1 MでMilliQ水にとかしたもの、Tris-HClは10.1 mMに希釈したもの（pH=7.4）を用いています。 NTAの終濃度が10 mMになるように調整しました。 Tris-HClは5.17275ml、NTAを溶かした溶液は0.05225 mlです。 それぞれの酸解離定数はNTAがpK1=3.03、pK2=3.07、pK3=10.27、Tris-HClが8.08です。 0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl pH7.6の簡単 0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl pH7.6の簡単な作製方法を教えてください。 よろしくお願いします。 TE bufferのpH。 TE buffer（10mM Tris-HCl + 1mM EDTA, pH8.0）のpHが8.0の理由って何なんですか？ 初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。 １．５ＭTris-Hcl(ph8.8）のつくりかた 初歩的な質問ですみません！ 具体的に作り方をお教えください。 （1.5×Ｔｒｉｓの分子量）ｇのＴｒｉｓを 900mlくらいのMilliQに溶かしたのち Hclを加えて990ｍｌほどにするのですか？ （のこり10ｍｌ でpH調整？？） よろしくお願いいたします。 ウエスタンブロッティング法のブロッティングについて ウエスタンブロッティング法のゲルからブロッティン紙にブロッティングする際に、3回に1回ぐらいブロッティン紙の一部がちょっと透けたようにみえることがあり、このときは決まってうまくいきません。（バンドが出ず、でても相当薄いです）時間が長すぎるのでしょうか？どこが悪いのか教えてください。 ブロッティングの時間は1時間45分で200V,200mAで行っています。紙は、milliporeのimmunobilonを使用しており、wet法でやっています。 緩衝液の調製する際の希釈 緩衝液を調整する際にまずTrisを純水に溶かし、溶液のｐHをｐHメーターで測定後、目的のpHまでHCｌを加えました。最後に純水を加えて最終的な体積としたのですが、このとき加えた純水によってpHは変化、小さくならないのでしょうか？それとも緩衝液なので無視してしまってよいのでしょうか？ 日本史の転換点？：赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム 緩衝液の作り方 Bufferの調整で，例えば以下のように組成が書いてあったら，具体的にどのような手順で作ったらいいのでしょうか？ 50 mM Tris-HCl, 0.9％ NaCl, 0.5％ BSA, 0.05％ NaN3, 0.01％ Tween-40, 20 μM DTPA, pH7.75 oligo(dT)-celluloseによるmRNA精製法 oligo(dT)-celluloseによるmRNA精製を行いました。 Bufferとして 1) 10mM Tris-HCl - 1mM EDTA - 0.5M NaCl 2) 10mM Tris-HCl - 1mM EDTA - 0.1M NaCl 3) TE Buffer (10mM Tris-HCl - 1mM EDTA) を使いました。 1,2のBufferを使うことによって何故rRNAとtRNAを濾液として抽出されるのか。また、TE Buffer(70℃)にはRNAsecureが含まれているのですが、それによって何故oligo(dT)-celluloseとの水素結合が切れて抽出されるのかが分かりません。 知識を恵んでください。お願いします。 教えて 100 mM Tris-HCl と 1 M NaCl 水溶液, および蒸留水を, それぞれどれだけずつ混合すればよいか教えてください。 (a) 20 mM Tris-HCl を 20 ml (b) 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl を 10 ml (c) 20 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl を 10 ml 教えてください。 授業でTris-Hclの緩衝液について学びました。 Tris-HClについて詳しい本もしくはインターネットサイトはありませんか？ ぜひ教えてください。 ウェスタンで転写されないタンパク 活性染色ではポジティブの培養上清中のタンパクがウェスタンでは検出されなかったため、転写後のゲルをCBB染色してみたところ、目的タンパクサイズ付近のみ、くっきりゲル上にバンドが残っていました。気泡などの問題ではなく、何度やってもバンドとしてくっきり残っています。目的タンパクのｐIは６くらいで、使用している転写バッファーはｐH8.6くらいです。ｐHに問題はないように思えるのですが。。。セミドライよりウェットの方が良いのでしょうか。また、In Gelで行うものも最近ありますが。どなたか同じような経験された方いらっしゃいますか。 ウエスタンブロッティングについて アトーの泳動装置を使用しています。 いつもはゲル2枚で行っているのですが、ゲル1枚で行なってもよいものなのでしょうか？ Western blotting について ラット大腸粘膜をスクレイプしたサンプルを用いてWestern blottingを行っています。 現在、β-catenin (Cell signaling #9562 Rabbit poly)の検出をトライしているのですが、Positive controlのβ-actin(SIGMA Mouse mono)は発光30秒でしっかりバンドが確認できますが、肝心のβ-cateninは10分発光しても全くバンドが出現しません。 ウェルに注入するサンプルはタンパク量10μgで10μl前後です。 ブロッキングは5%スキムミルクで一晩、 １次抗体は添書通りの1;1000の希釈で室温60分、 β-cateninの２次抗体にはABR社のDonkey Anti Rabbit HRPを用いて、添書では1:2500の希釈を1:1500で室温60分反応させています。 発光にはECLを用いてLAS-1000 plusで撮影しています。 Western blottingの経験がほとんどないため、どこから改善していくべきか教えてください。 メンブレンは冷凍保存しています。 ウエスタンブロッティングで １－細胞を免沈したものをウエスタンのサンプルとして使うとき、フリーズしておいたものを使うのですが、それを溶かす熱処理は５０～６０℃位のお湯で溶かして使ってます。 この時熱がサンプル内の蛋白に悪影響が及ぶことはあるのでしょうか？あまりに熱すぎるお湯だとよくないですよね？ ２－ブロッキングはスキムミルクをBufferで５％にして使ってますが、スキムミルクでブロッキングされるメカニズムを教えてください ３－ブロッティングの際メンブレンは素手ではもちろん触りませんが、ゲルを重ねる時は素手です； 皆手袋をしてやっているのですが、やはり素手ではよくないでしょうか？結果に影響が出たことはまだありませんが・・ケラチン等がついているのかな？と。 質問が基本的かつ多くて申し訳ありませんが、まだ知識が足りないところがあったので気になりまして、本にも載っていないので教えてください！ 注目のQ&A 「You」や「I」が入った曲といえば？ Part2 結婚について考えていない大学生の彼氏について 関東の方に聞きたいです 大阪万博について 駅の清涼飲料水自販機 不倫の慰謝料の請求について 新型コロナウイルスがもたらした功績について教えて 旧姓を使う理由。 回復メディアの保存方法 好きな人を諦める方法 小諸市（長野県）在住でスキーやスノボをする方の用具 カテゴリ 学問・教育 自然科学 理科（小学校・中学校）化学物理学科学生物学地学天文学・宇宙科学環境学・生態学その他（自然科学） カテゴリ一覧を見る OKWAVE コラム 突然のトラブル？プリンター・メール・LINE編 携帯料金を賢く見直す！格安SIMと端末選びのポイントは？ 友達って必要？友情って何だろう 大震災時の現実とは？私たちができる備え 「結婚相談所は恥ずかしい」は時代遅れ！負け組の誤解と出会いの掴み方 あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVE セレクト コスメ化粧品 化粧水・クレンジングなど 健康食品・サプリ コンブチャなど バス用品 入浴剤・アミノ酸シャンプーなど スマホアプリ マッチングアプリなど ヘアケア 白髪染めヘアカラーなど インターネット回線 プロバイダ、光回線など
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