ベストアンサー ウェスタンブロット 2007/07/27 12:14 ウエスタンブロットで、二次抗体の濃度を10倍濃くやってしまいました。 かなりバックがでてわかりづらいのですが、ウォッシングすればキレイに見れるでしょうか？？ リプロービングが必要でしょうか？？ みんなの回答 （1） 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー Amakosan ベストアンサー率44% (4/9) 2007/07/27 14:22 回答No.1 １．wash回数、時間を増やす ２．wash bufferをhigh-soltにして再度wash 上記2項でもbackが高く、specific bandが不明瞭ならば、剥がせばよいかと思います。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学生物学 関連するQ&A ウエスタンブロットの抗体について ウエスタンブロットの抗体について ウエスタンブロット初心者なのですが、抗体について質問です。 EGFRの発現とリン酸化について調べたいのですが、その場合一次抗体は何を買うべきでしょうか？ 調べると、anti-EGFR antibody、antiphosphotyrosine antibodies PY 20 and PT 66 を使った論文が出てきましたが、よく分からないです。 抗体のカタログを見るとリン酸化EGFRと書いてある抗体もあります。 お詳しい方、実験の手順も含めて教えていただけると助かります。 ウエスタンブロットについて 質問させてくださぃ！！ ウエスタンブロットの ブロッキング→１次抗体をつける→２次抗体をつける という流れを詳しく教えてほしいです。 ブロッキングはスキムミルクをT－TBSに溶かしたものをタッパーに入れて揺らしたらいいんでしょうか？？ １次抗体はラップを引いてその上に１次抗体とキャンデットシグナルをたらしメンブレンをつけるので合ってますか？？ ２次抗体はどのようにつけるのでしょうか？？ 間に挟むWASHについても教えてほしいです。 よろしくお願いします！！！ ウエスタンブロットで二次抗体を用いる理由 ウエスタンブロットは標識二次抗体を用いて行うと思うのですが、なぜ標識一次抗体ではなく標識二次抗体を用いるのでしょうか？ このように標識二次抗体を用いて、標識二次抗体とたんぱく質との間に標識していない一次抗体を挟む必要性があるのは、たんぱく質に直接標識抗体を結合させたら何か問題があるからなのでしょうか？ 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた？ OKWAVE コラム ウエスタンブロットと免疫染色について 同じ抗体と細胞を用いて、ウエスタンブロットと免疫染色をした場合に、ウエスタンブロットで反応があっても、免疫染色では反応が見られないなどということが起こったりするのでしょうか？？ご存知の方がいらっしゃったらぜひ教えてください。 ウエスタンブロット法について。 こんばんは。 ウエスタンブロットについて行き詰っています。 実験で1次抗体にβ-アクチンを使用しているのですが、 どのような意味があるのでしょうか？ β-アクチンを使用することから、予想される目標物質とは何があるでしょうか？ よろしくお願いします。 ウエスタンブロットは上手くいかないが免疫染色可能な場合 実験経験の浅い者です。初めて質問します。 細胞質、細胞膜上で発現しているあるタンパクに対する抗体を作成中です。既報にならって、合成ペプチドから抗体(血清)を作成しました。 目的の抗体ができているかを確かめるために、ELISA、ウエスタンブロット、免疫染色をしたのですが、ELSA、免疫染色は問題なく、ウエスタンブロットだけうまくバンドがでませんでした(非特異的なバンドのみ)。 発現しているはずの細胞を抗原としてβ-メルカプトエタノール、SDS入りのサンプルバッファーで溶解処理して、通常のSDS-PAGE、1次抗体は血清、2次抗体はWB用の抗体を使用しました。 免疫染色では、血清を2000倍希釈しても十分染色できました。 高次構造が変わると抗原性がなくなってしまうということなのでしょうか。 だとすると、ウエスタンブロットでは、還元剤なしにするとよいのでしょうか？何かよい方法はありますでしょうか。 よろしくお願い致します。 ウェスタンブロットについて 先日、ウェスタンブロットをしていて発色試薬を入れて3分後にメンブランを見てみるとメンブラン上に茶色いバンドが現れていました。 このバンドの原因が何か分からないので 分かる方いらしゃいましたらよろしくお願いします。 サンプルは、GSTタグで50倍希釈しました。 ウェスタンブロットについて質問です 私が所属している大学の研究室ではSDS-PAGE→メンブレンへの転写→一次抗体反応→二次抗体反応→DAB染色の手順でウェスタンブロットを行なっています。 そこで質問ですが、タンパク質をメンブレンへ転写後にそのメンブレンをストックすることはできるのでしょうか？また、ストックできるのであればどのような方法でストックすればよいのでしょうか？ どなたか回答よろしくお願いします。 ウエスタンブロットについて 始めまして。 現在、ウエスタンブロットにより蛋白の検出を行っているのですが、うまくいきません。どなたかアドバイスをいただけませんか。。 human由来の抗体で、私のサンプルは違う動物種なのですが、抗原認識部位の相同性は97％でした。 内部標準の検出はうまくいくのですが、目的の蛋白の検出は何度条件を変えてやってみてもうまくいきません。 目的の分子量の部分には、非特異が多いのもあり、なかなかバンドが確認できません。しかし、一度だけ、非特異はあったものの発現量の比較も出来るほどのバンドが出たこともあります。 しかし、同じ条件で行ってもきれいなバンドはその一度だけしか見られていません。 非特異が多いので、二次抗体の希釈を変え、何度もやってみてはいるのですが、目的の蛋白は検出できていません。 現在、違う抗体を購入しようか検討中なのですが・・・。 まだ、同じ抗体でやってみる価値があるのかどうか、どなたかご助言いただけたらなと思います。よろしく願いいたします。 ウェスタンブロットについて 今、ウェスタンブロット法で腸管のmicrosomeを使用し、実験を行っているのですが、内標準としてβ-actinが何故か揃わなかったり、全く発現しなかったりします。そもそも、論文等でウェスタンブロットを行う際にβ-actinを内標準として用いるケースがあるものの、microsomeを用いた実験ではβ-actinを用いているケースをあまり見かけない事に気付き、やはり、microsomeを扱う実験ではβ-actinは揃わないものなのでしょうか？回答をお願い致します。 ウェスタンブロットについて ウェスタンブロットって難しい実験なのですか？ なかなか思うように結果がでないのですが。 安定して結果が出せるものなんでしょうか？ ウエスタンブロット法の検出 これからウエスタンブロット法を立ち上げようとしているものです。 そのため、装置などは全然そろっていません。 いろいろ調べているのですが、検出をどのように行うか悩んでいます。 予算の関係もあり、高価な装置を購入することはなるべく避けたいと思っています。 現在のところ、二次抗体を酵素標識の抗体にして、DABなどで検出しようと考えているのですが、この場合、肉眼で確認できる程度まで色がつくのでしょうか。それとも、高感度の検出装置が必要なのか、知っている方がいらっしゃれば教えてください。 日本史の転換点？：赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム western blotについて 時間、手間がかかるwestern blotって難しい実験なんですか？ CBBより感度は良いようですが。 フィルムに焼くとき汚れ（バックグラウンド）がでてきて困っています。 ウエスタンブロットのコントロール ウエスタンブロットのコントロールについて教えて下さい。 ある分子の発現量変化を見たいときに、アクチンやチューブリンなど発現が変化しないコントロールをとりますが、今見ようとしている分子はアクチン、チューブリンとも発現が一緒に変化してしまう可能性があるものなので、他のコントロール分子を探しています。リボソーム関連の分子が良いかと思うのですが、何か、ウエスタンのコントロールとして一般的に使われていて抗体の入手が可能なものがあったら教えて下さい。 ウエスタンブロット ウエスタンブロットをしているのですが、目的とするタンパク質はバンドがでるのですが、 βアクチンやGAPDHのバンドが薄かったり、ぼんやりしていたりと、わかりづらいです。 何か改良することにより観やすくなるのでしょうか？？ よろしくお願いします。 ウェスタンブロットについて トラブル ここ２ヶ月ほどウェスタンブロッティングしたおります。しかし、現像してもバンドが5回に1回にポジコンマでもが全く検出できなくなります。ミルクは５％スキムミルク、０．１％牛アルブミン、PBS-TでｐH７．４にし、一次抗体、２次抗体の濃度は間違っておらず、最後のECLの濃度も間違っていません。メンブレンにちゃんと転写されているかの確認（ポンソー染色にて）行ったところちゃんと転写されていました。原因が分からず本当に困っております。どなたか分かられる方教えてください 免疫染色やウエスタンブロットで 以前、組織の免疫染色で１次抗体は１時間はんのうさせ、２次抗体をオーバーナイトにしたのですが、バックが高くなってしまいました。 ウエスタンでも２次抗体でオーバーナイトだとバックが高くなると話に聞きました。 何故２次抗体だとバックが高くなるのですか？ 非特異反応がふえるのですか？ブロッキングしていても？ バックが高くなるということは１次抗体がついてない所（本来みたい部位）にもつくわけですよね？ 実験方法で・・・（ウェスタンブロット） ２１歳、卒研始めたばかりの新米です。最近実験でウエスタンブロットを始めました。 そこで、メンブラン（膜）をx-rayで現像したのですが、その後、このメンブランから抗体を取り去ってもう一度別の抗体を使ったりして再利用できると聞きました。サンプルが手に入りにくいので是非この方法を取り入れたいのですが、この方法を使っている方がいらっしゃればご意見を頂けたらと思います。また、何回くらい繰り返し使えるのかや使っているプロトコールなども少し教えてあげようと言う優しい方がおられたらお願いします。 ウエスタンブロット 発色の原理は・・・ こんにちは。よろしくお願いします。 職場で、ウエスタンブロットを行っています。 タンパク質を転写したメンブレンに、サンプルを反応させて、１次抗体、２次抗体後、過酸化水素ごく少量にDABを入れて、しばらく置くと発色し、水中に入れ反応を止めます。 ここで、そぼくな疑問なのですが、過酸化水素とDABを入れるとどうして発色するのでしょうか？ DABがペルオキシダーゼ基質ということは知っています。 色々ネットで調べましたが分かりませんでした。 よろしくお願いします。 ウエスタン・ブロット ウエスタン・ブロットで得られたバンドが (1)大きく（時にはバンドより大きいです）滲んでいたり (2)縦にスジが入ったり、します。 (3)また、バンド以外の部分にシミの様な黒点が現れる時がしばしばあります。 初心者なので、その原因が判りません。何が原因でしょうか？ また対策がありましたらお教えいただけないでしょうか？ どうぞよろしくお願いします。 注目のQ&A 私はとてつもなく運が悪いです。 外付けHDD「このフォルダーは空です」 中3 夢に向かって努力をしたい 自分を変えたい 出会い系で知り合った人妻について 一方的に親友に縁を切られました LIFEBOOK A577/P A746 飲み薬 タイヤ比較検討 パソコンのスペック 突然、知らない親族の未払金支払い通知が届きました カテゴリ 学問・教育 自然科学 理科（小学校・中学校）化学物理学科学生物学地学天文学・宇宙科学環境学・生態学その他（自然科学） カテゴリ一覧を見る OKWAVE コラム マッチングアプリは顔写真が重要！容姿に自信がなくても出会いを見つけるには 美容男子ミドル世代の悩み解決？休日ファッション・爪・目元ケア プラモデル塗装のコツとは？初心者向けガイド 突然のトラブル？プリンター・メール・LINE編 携帯料金を賢く見直す！格安SIMと端末選びのポイントは？ あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVE セレクト コスメ化粧品 化粧水・クレンジングなど 健康食品・サプリ コンブチャなど バス用品 入浴剤・アミノ酸シャンプーなど スマホアプリ マッチングアプリなど ヘアケア 白髪染めヘアカラーなど インターネット回線 プロバイダ、光回線など
