ウェスタンブロットについて

質問

ウェスタンブロットって難しい実験なのですか？
なかなか思うように結果がでないのですが。
安定して結果が出せるものなんでしょうか？

回答No.1

happy-engawa · ベストアンサー

ケースバイケースだと思います。
　抗体の質と目的のタンパクの発現量が、ポイントだと思います。
　抗体の質が悪いと、目的のタンパク以外も認識して、分かりづらくなります。また、目的のタンパクと同じ分子量の位置にシングルバンドでシグナルが検出できても、実は全く違うものを認識してしまっていることもあります。
　抗体が良くても、サンプル中の目的のタンパク質の量が極微量だと、検出が難しくなります。
　また、大きなタンパク質は、膜へのtransferがされにくということがあります。
　検出方法も重要です。目的によって、低感度、高感度の系を使い分ける必要があると思います。

お礼

回答ありがとうございます。
＞目的によって、低感度、高感度の系を使い分ける必要があると思います。
これはどういうことですか？
感度の系の意味が分かりません。

回答No.6

kazu-ura

0.5% PonceauS/1%酢酸の溶液で転写後のメンブレンを染めてみてはどうですか？十秒程度液に浸し、水で洗浄します。各レーンごとにピンク色のバンドが見れます。目的のタンパクの位置に強いバンドが見られた場合、WBの際、非特異的な反応を拾うことがありますので、私は初めて使う抗体の場合、この染色をしています。あと、染色後、レーンごとに短冊状に切り、抗体の濃度を振って最適濃度を見つけることも可能かと思います。ただし、Ponceauが抗体の反応に全く影響しないとは言い切れませんので、予備試験で行ってください。染色後はTBSTかPBSTで脱色できます。その後にブロッキングしてください。

回答No.5

Chicago243

マーカーが転写されているだけでは
ちゃんと転写ができているかどうかは判断できないのですね。
スポンジは何の役目をしているんですか？

スポンジは単にゲルや膜をholdして、ずれたり動かなくしているだけです。もし、スポンジを疑うなら濾紙を何枚か使いスポンジを使うのを避けるのもてかもしれませんが、それはやったことがないのでいい方法かどうか分かりません。マーカーはトランスファーの目安になりますが、完全に同じではありません。特に色素がついていますから。トランスファー後膜をなにかで染めてみるのも手です。

もしスポンジが3枚以上あるならばそれぞれ印か何かを入れて、うまく入ったやつを覚えとくというのも手です。そうすると使えないスポンジがあることを理解してもらえると思いますので、購入することを理解してもらえるかと思いますが、、、、

サンプルによっては一度で結果が出たことがあります。
サンプルによって抗体濃度などは変えていくなど試行錯誤が必要な実験なんですかね？

サンプルに応じてコンディションを探るというのはあまりないと思います。ただ、非常に簡単に検出できる系でしかやってない(結構多い量が得られる、大腸菌のリコンビナントやCosの過剰発現など)場合は再検討が必要かもしれません。いずれにしても、このサンプルなら検出できるというコントロールを毎回加えることが、問題解決の糸口をつかむのに重要です。

ようじ調整
使う直前(使う日)に作る(ミルクとPBST/TBSTを混ぜる)ということです
PBST/TBSTは作り置きでもいいですが、コンタミに注意することが必要です。

TBS（T)とPBSTはほとんど一緒だと私は思っています。抗体によって愛しょうがあるかもしれませんが、、、、

お礼

回答ありがとうございます。
＞トランスファー後膜をなにかで染めてみるのも手です。
膜を染めてもいいんでしょうか？
その後、ブロッキングをして、抗体反応をするのですが、
支障が出ないならやってみたいと思いますが。

ミルクは使う日に作っていますよ。
TBSTはみんな結果を出しているので問題ないと思います。
10Xを作っておいて希釈して使っています。
コンタミとはケラチンのコンタミですか？

回答No.4

happy-engawa

#1のものです。

「低感度、高感度の系を使い分ける必要があると思います。」の件ですが、検出はＥＣＬでしょうか？コントロールのベータアクチンなどは、ＥＣＬでも十分ですが、発現量が弱いものは、より高感度の検出系（例えば下のリンク）を使うと検出できることがあります。

http://www.technochemical.com/pierce/supers/westfmt/wstfmt.htm

それから、マーカーが膜に転写されても、目的のタンパク質も、転写されているとは限りません。転写した後のゲルを染めると、結構タンパク質が残っているかどうかわかります。高分子量なら、トランスファーの時間を伸ばす選択肢もあります。

ちなみに、ある特定のタンパク質の検出が出来ないんでしょうか？それとも、ベータアクチンとかGAPDHのようなポジコンも、検出できないのでしょうか？

回答No.3

Chicago243

>つまぐきやすいポイントというのは抗体の濃度、種類
>などでしょうか？

一度系が確立してしまえばあまりつまずきそうなとことはないですが、、、抗体の保存状態が悪かったとかぐらいでしょうか。もう一つはブロッキングや洗じょう用の溶液(PBSTなど)にバクテリアが増殖してしまうことがありますが。ブロッキング溶液はようじ調整、PBSTは4度保存、使い終わった瓶はよく洗って滅菌か、殺菌するように心がけるとかですが、、、前回流してバンドがでたサンプルを必ずポジコンとして流すなどするのがいいかと思います。
あと、ブトッティングはwetの系ですか?スポンジが古くなると詰まってきてトランスファーがディフューズになり、検出感度ががくんとおちることがあります。これはマーカーのトランスファーの様子だけでは判断できないことが多いです。

お礼

回答ありがとうございます。マーカーが転写されているだけでは
ちゃんと転写ができているかどうかは判断できないのですね。
スポンジは何の役目をしているんですか？

サンプルによっては一度で結果が出たことがあります。
サンプルによって抗体濃度などは変えていくなど試行錯誤が必要な実験なんですかね？

＞ブロッキング溶液はようじ調整、PBSTは4度保存、使い終わった瓶はよく洗って滅菌か、殺菌するように心がけるとかですが

ようじ調節とはどういうことですか？
また、洗浄液は全然滅菌してませんが。
ちなみにTBS（T)を使っています。

＞ブトッティングはwetの系ですか?
wetです。スポンジも古いと思います。これが原因かもしれませんね。
しかし、他の人がちゃんと結果を出しているので変えることはできないと
思います。

回答No.2

Chicago243

>安定して結果が出せるものなんでしょうか？

実験系がすでに樹立している抗体では安定して出せるはずです。

>なかなか思うように結果がでないのですが。

何かポジコンがありますか?どこでつまずいているのでしょう。

お礼

転写まではできていると思います。
マーカーは転写されていますので。
つまぐきやすいポイントというのは抗体の濃度、種類などでしょうか？