免疫染色やウエスタンブロットで

質問

以前、組織の免疫染色で１次抗体は１時間はんのうさせ、２次抗体をオーバーナイトにしたのですが、バックが高くなってしまいました。
ウエスタンでも２次抗体でオーバーナイトだとバックが高くなると話に聞きました。
何故２次抗体だとバックが高くなるのですか？

非特異反応がふえるのですか？ブロッキングしていても？
バックが高くなるということは１次抗体がついてない所（本来みたい部位）にもつくわけですよね？

回答No.2

fujishiro · ベストアンサー

時間が経てば非特異的、特異的に関わらず反応が進むのは当然です。
特異的反応がその反応の速さから比較的短時間でプラトーに達するのに比べ、非特異的反応は（ある程度までは）時間をかければかけるほど進むでしょう。特に二次抗体は一次よりも非特異的反応の余地が大きいのでオーバーナイトで長い時間をかければ当然、バックは上がることになるでしょうね、濃度しだいとは思いますが。

ブロッキングというのは所詮は非特異的反応です、あらかじめ非特異的反応を起すことで検出時の非特異的反応を下げるっていうだけなのでまったく万能という言葉からは程遠いです。もちろん、ブロッキング剤の種類と濃度によりますが。

よってブロッキングだろうが一次抗体だろうが二次だろうが適切な濃度、反応時間というものがあるというだけのことです。

お礼

ブロッキングは万能でないのですね。分かりやすい説明ありがとうございました。

回答No.1

ga111

何故２次抗体だとバックが高くなるのですか？
おそらく、短時間用に濃度が設定されているからで、濃度を再検討すれば改善は見られる可能性あり。
しかし、特異的1次抗体で終夜やるのが、理屈からもいいでしょうね。

非特異反応がふえるのですか？
Yes
ブロッキングしていても？
Yes
バックが高くなるということは１次抗体がついてない所（本来みたい部位）にもつくわけですよね？
Yes

お礼

濃度を薄くすればマシになることもあるということでしょうか。
ありがとうございました。