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In VitroのKDアッセイについて
- Invitroの結合実験で最大結合量とその結合比について調査しました。試験では、25pmolのGSTプロテインをGSHビーズにくっつけて、10pmolから600pmolのMBPタンパク質を加えました。結果として、結合量は飽和時に600fmolであり、最大結合比は100対2程度でした。
- 一方、リガンドタンパク質に対する結合比は1000対1程度と異常に高い値が得られました。同時に、ビーズにくっつけたタンパク質の増加も結合量の増加につながっていきましたが、200pmol程度のビーズでは結合が飽和しない傾向も見られました。
- これにより、ノンスペではなくリガンドタンパク質の問題があると推測されます。しかし、このような結果は論文で見たことがありません。現在はアドバイスを求めています。
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＞BoundとFreeを分けて測定？？ 誤解を招く表現でした。すみません。 Freeは既知ですので、実際に測定するのはBoundだけです. ＞バッファーによるＷａｓｈが数度入ることで、タンパクが希釈される状態の平衡が、、、、、、、 乖離がそれほど早い場合は、このままではＫｄ値は求められません。 正確に求めたい場合は、タンパク同士ですので、likerを使うとか、対策が必要かと思います。 Ｋｄが最終目的でないなら、おおよそ（100nMで飽和するなら、Ｋｄ＝10nM前後）でいいのではないでしょうか？
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- ebikichi
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すみません。GSTについては詳しくないので、、、 このような実験をする場合、boundとfreeを分けて測定しなければなりません。（FPやFRETですと分ける必要はありませんが） それをB/F分離といいます。 B/F分離がきちんとでき、ノンスペも十分低いのであれば、boundとfreeが１０００倍差があっても問題はないはずです それより結合比2-3:100はacceptableですか？
お礼
BoundとFreeを分けて測定？？ Freeのタンパク質の量は、反応に用いたタンパク質の量（あらかじめ定量した濃度と加えた量から算定）から結合したものを引いた値を用いてます。 これでは問題があるでしょうか？ ＊＊ 実験状況は、 チューブの中にタグ付タンパク質＝レセプター（量固定） リガンドタンパク質（濃度を振る）、そしてタグタンパク質をPull downできるように 少量のbeadsを加えて、反応させています。 ノンスペを落とすために、遠心法でビーズを回収した後＝当然ビーズにくっつくレセプターもそこにくっつくリガンドも一緒に回収されます Ｗａｓｈバッファーを加えて攪拌、遠心回収を繰り返します（トータルでビーズの容量の4倍を5回）。 結合リガンドはＳＤＳ－ＰＡＧＥ以降のバンド染色を用いてます Ｆｒｅｅのリガンドは、スタート時に設定した量から結合したリガンドを引いた値を用いてます。 ＊＊ 結合比に関してですが、 ＧＳＴタンパク質をGSHビーズにくっつけてバッジ法で行うバインディングアッセイで求める場合、 いいとこ10対1くらい、 という話を鵜呑みにして判断しています＝論文になったもので、100対4くらいのものもあった。 これは、元の平衡反応の後、バッファーによるＷａｓｈが数度入ることで、タンパクが希釈される状態の平衡が繰り返されることで、理想的な1対1比から外れていってしまうのだと理解しています。 しかし確かに弱いという気はします。
- ebikichi
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Ｂ/Ｆ分離はきちんと出来ていますか？
お礼
回答ありがとうございます。 B/F分離とはどういうことでしょうか？ 最終的に結合したリガンドタンパク質をＢｏｕｎｄ として そこから最初の反応系に加えたリガンドタンパク質を引いたものをＦｒｅｅリガンドとして考えています。 今の条件だと結合しているリガンドの割合は、加えたリガンドの割合に加えて圧倒的に小さいです。（結合が最大で-000fmol に対し加えているタンパク質は000pmolオーダー） レセプター側の（Ｂｏｕｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）/（Ｆｒｅｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の比は リガンドが飽和する濃度で２－３/１００ です。
お礼
何度もご回答いただきありがとうございました。 おかげさまでかなり理解がすすみました。 他の実験結果とあわせて引き続き検討したいと思っています