westernの際のタンパク量

質問

いつも、10wellのゲルを使い、通常総タンパク量25μgをアプライしています。
今回cell lysateを作り濃度を測ったところ、いつもより半分程度の濃度しかありません。
よって、アプライするタンパク量を減らしてみたいと思うのですが、皆さんは10wellのゲルですと、最低どのくらいのタンパク量をアプライされますでしょうか。

回答No.2

bunnosukehina · ベストアンサー

検出系による違いはあると思いますが、ECL+という発色系で、哺乳動物のCell Lysate,50ng/wellまで希釈しても、ある種の酵素蛋白がDetectionできた経験があります。
もっと感度の高い検出系があれば、さらに薄めても大丈夫かも。Cell Lysate なので、pgオーダーはさすがに厳しいと思いますが。

お礼

ありがとうございます。
私どもが使っているのもECL＋です。
細胞は、ヒトの癌細胞です。
目的とする蛋白は、リン酸化蛋白です。
１０μgぐらいはアプライできそうなので、十分ですね。
濃縮せず、そのままトライしてみようとか思います。

回答No.3

happy-engawa

＃１のものです。
　もし、ECL+で検出できなかったら、ピアス社の"SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate”をお奨めします。
　参考URLを載せておきました。ECL+と比べて、非常に高感度であることが分かると思います。 感度がぜんぜん違います。ECL+の感度では、見えないバンドでも簡単に検出できます。
　もちろん、第一に抗体の特異性が高いことがなにより大事ですが。

参考URL：

http://www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=01041106

お礼

再度ご回答いただき、ありがとうございました。
#2さんからご回答をいただいた後、10ugでトライしてみたところ、バンドが検出できました。
しかし、こういう試薬の存在を知りませんでしたので、大変勉強になりました。
ありがとうございました。

回答No.1

happy-engawa

スタンダードカーブを作りたかったので、
50, 25, 12.5. 6.25, 3.125μgと希釈して、アプライしたことがあります。もっと、少ない量まで希釈したこともあると思います。

大丈夫かどうかは、
１．目的のタンパクがどのくらいサンプル中にあるか？
２．どんな検出法で検出するか？
ということです。
これは、ケースバイケースなので、自分の実験系で、どこまで少なく出来るか自分で予備実験をやりましょう。一度やれば、本試験を自信をもってやれますよ。

お礼

ご回答ありがとうございました。
いずれやりたいと思いますが、今回は回収できたタンパク量が少なく、十分な量をアプライできないのです。
そこで、どれくらい少なくできるか、と思ったのです。
次善の策として、濃縮してみようかとも思ってるのですが。
ボスは、そのようにした蛋白では、westernはあまりうまくいかない、と言うのですが。