タンパク質の精製 アフィニティにくっつかないんですが・・・

質問

はじめて質問します。学生です。
原株からあるNADPH依存のタンパク質を単離精製しているんですが、収量が少なく、より良い精製法を検討中です。

NADPH特異性のあるCibacron Blue F3GA色素を担体リガンドとした、いわゆるBlueカラムを試したのですが、目的酵素が結合せず、うまくいきません。（正確には少し結合しているようで単ピークで溶出するのですが、素通り画分の方が酵素活性が高い状態です。ベット量はカラムのタンパク質結合容量以下でやっています。）
至適ｐＨのリン酸バッファーで、KClでグラジエント溶出しています。
（カラムの説明書通りの条件です。ただし説明書ではアルブミンを精製しています。）
結合しない原因は何なのでしょうか？　或いは陥りやすい操作ミスなど、少しでもわかる方は是非教えてください。

また、文献を探したところ、酵素溶液に基質を加えたり補酵素を加えたりすることで結合容量が増すようなことが書かれているものもあったのですが、その他に検討すべきことはあるでしょうか？

ご存知の方いましたら、ご教授願います。

回答No.2

tamucchi21 · ベストアンサー

イオン交換ではＱＡ（第四アンモニウム基：強陰イオン）かＳＰ（スルホプロピル基：強陽イオン）を試してみては？欠点としては強力に結合しすぎて溶出し難いこともありますが、その時は、弱陰イオンのＤＥＡＥや弱陽イオンのカルボキシメチル基を選ぶのが良いかと。
疎水クロマトではオクチルかフェニルかな？

あと、Blueカラムに結合させる際、pHを1ぐらいずつ変えて試してみては・・・？

お礼

なるほど、いろいろあるんですよね。
強アニオンとかでも何種類かあったり、担体ビーズの材質が違ったり・・・
強カチオンはまだ試していないので、やってみようと思います。

Blueも結合メカニズムがよくわからないので、いろいろ条件を変えてやってみるしかないですね。

参考になりました、ありがとうございました！
これからもまた様々質問すると思いますので、見かけたら是非よろしくお願いします！

回答No.1

tamucchi21

NADPH特異性と言ってもBlueカラムにこだわる必要が無いような気がしますが？例えば研究室にある他のゲルとサンプルとを少量ずつ混合し、上清に酵素が少ない（ゲルに酵素が多くくっついてる）ゲルを選択すれば良いと思います。
ゲルとの結合量を増やす１つとして、例えば、サンプルとゲルをチューブの中で混ぜて低温室で何日かローターで回してくっつけるとか。プレパックのカラムでは無理ですが・・・

お礼

回答ありがとうございます。
そうですね、他の担体も試したいと思うんですが、
あまりゲルとかがない研究室なもので・・・
どんなゲルをそろえるのがいいのでしょう？