Large size PCR(7kb)のCloningについて

質問

今、合計で７kbぐらいのOperonをCloning Vectorに入れようとしていろいろトライしているのですが、ぜんぜん入る気配がありません。VectorはｐTZ18RというVectorで２．８kbです。
７kbはLong template PCRである程度はAmplify出来るのですが、Vectorの量と比べると全然少ないです。(PCR～100pmol)。また、PCRの両端にRestriction siteをデザインしています。(とても大きいサイズなので、Enzymeを見つけるのが大変でした。）
現在、何がうまくいってないのかよく分かりません。DNAの濃度が良くないのか、そもそも7kbという大きいFragmentを２．８Kbに入れようとしているのが無理なのかまだ大学院に入ったばかりなのでよく分かりません。どんな意見でも良いのでアドバイスをよろしくお願いします。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

プラスミドベクターへのサブクローニングはインサートサイズが大きいと効率が低くなりますが、これはライゲーションの問題というよりは、形質転換効率の低下によると考えてよいです。Chemical法では、ベクター＋インサートが10　kb前後を越えるあたりで一桁ちかく下がります。これはあらかじめ完成して精製済みのプラスミドを使っても同じです。

その点、
electroporationは大きいサイズのプラスミドに強いので、もし装置があるなら試して損はないです。
これで私は、3 kbベクターに15 kbを越えるインサートをクローニングしたこともありますし、Bac clone DNAを（100 kb 弱の大きさ）を大腸菌に戻すときにもこれを使います。

制限酵素サイトの末端からの余裕はそれだけあれば充分んだと思います。
TA cloningもいい方法だと思います。同じライゲーション反応なのでTA cloningが特に大きいインサートに弱いということはないです（たぶん形質転換効率の問題です）。それと、インサートとベクター量や比をえらく気にする人もいますが、私はあまり、、、。比はベクターあたりで、インサートをもつライゲーション産物ができる効率に影響するので、ライブラリーを作るときには重要ですが、10000個だろうと10個だろうと取れればいいというサブクローニングのときはそうでもないです。私は、インサート、ベクターとも20～50 ng 前後の適当な量でライゲーションしています。

お礼

アドバイスどうもありがとうございます！やはりChemicalとElectroporationではそんなに違いがあるんですね。次にやるときはElectroporationでやってみようと思います。(借りられるみたいなので。)
制限酵素サイトの末端からの余裕はVector場合も大丈夫でしょうか？(7－8bp)いろいろとありがとうございます。

回答No.8

MIYD

No.4です。

O/Nというのはover nightの略で一晩反応させるという意味です。
人によっては1~数時間反応してトランスフォーメーションに持っていく場合があるので、反応が短いようだったら長めにしてみてはいかがでしょうか。

PEGの話は
DNAの高次構造に変化を与えてライゲーションしやすくするために、
長いDNAは反応しにくくなると同じラボの上司？に言われたことがあるので書きました。
(見かけのDNA濃度を上げてライゲーション効率を上げると言う人もいます)

takaraのligation kitのbufferにはPEGが入っていて、
T4 ligase単体のbufferには入っていないくて、
kitで入らないときにligaseで反応させて取れるということがあるのですが、
invitrogenのbufferにはすでにPEGが入っているんですね。

根拠が良くわからないし、原因がどれかわかりませんが、
ligaseのメーカーやbufferを変えると入りやすい場合もあるので、
ラボにあったり、隣のラボから少しもらえるのでしたら
別のligaseを試してみてはいかがでしょうか。

お礼

一応、Overnightでもやってみたんですが結果は変わりませんでした...ほかのBuffer/ligaseもあれば試してみようと思います！またまたアドバイスどうもありがとうございます。

回答No.7

geneticist12

引っかかっていた点がはっきりしました。

PstIサイトの前後に一塩基ずつ認識サイトが延びているのがSbfIサイトです。
SbfIサイトはPstIでも切れて、付着末端も同じです（compatible end)。
異なる酵素で切ったcompatible endでライゲーションすると再切断できない場合が多いですが、この場合は再切断もできます。

ですから、PCR産物のほうは内部で切れてしまってだめだとしても、ベクターのほうは安価で切れやすいPstIを使うのが賢いかと。

お礼

これはPstIの方がぜんぜん安いですね！すばらしい情報を何度もどうもありがとうございます！
(やはりPCRの方はPstIで切れてしまいます。)

回答No.6

geneticist12

ちょっと気になりましたので、また戻ってきました。

pTZ18RのクローニングサイトにSbfIはあるのでしょうか？
ひょっとしてSbfIで切ったPCR産物の末端を、PstIで切ったベクター末端につなげる戦略ではないですか？

見当違いだったらごめんなさい。

お礼

SbfIはあると思います。実際にpTZ18Rはもらい物で、実際にSequenceしたわけではありませんが、ｐTZ18RのSequenceをNEB cutterに入れてやって、Mapを見るとsbfIがあります。(Circularの図だと全部のサイトが見れないので、Linearの図にしてみると全部見れます。)
overhangが同じであればどちらでも効率は同じなのでしょうか？

回答No.5

geneticist12

制限酵素が末端からどれくらいの距離でどのくらい働くかは、NEBのカタログやWEBサイトに資料があります。
たいていの酵素は2 bpあれば充分ですが、酵素によってはもっと必要なものもあります。それでも7-8 bpもあれば大丈夫だと思います。資料で確認してみてください。

PEGはライゲーションを促進すると言われていますが、chemical法の形質転換効率を下げます。ライゲーション産物を充分希釈して使うようにという注意書きがあると思います。もっといいのはエタノール沈殿して水に溶きなおすことです。
Electroporationの時は脱塩しないといけないので、エタノール沈殿は必須です。

お礼

Webサイトで調べてみたところ、xbaIは1bpでOKだったんですが、sbfIは6bpないとだめみたいでした。なので、多分大丈夫だとは思うんですが、sbfIで最初に切ってから、xbaIで切ってみようと思います。
Electroporationとライゲーション、がんばってみようと思います！
アドバイスどうもありがとうございました！

回答No.4

MIYD

ライゲーションを何で行っているのか良くわかりませんが、
takaraのライゲーションキットを使わずに、
T4 ligase＋bufferで14度、O/Nで反応させたほうが長いものは入りやすいといっている人がいます。
(PEGが悪さをするとその人は言っています)

1回TAクローニングして、
端っこを読んで確認してから改めて切り出したほうが楽だと思います。

でも、その場合はカラム精製ではなくて、
ゲルで泳動して切り出して、
目的のバンドを回収しないと非特異に増えたものも取れてきてしまいます。

7kbをクローニングした後に中身を全部読むと思うのですが、
そのときはダイターミネーター法で読む予定なのでしょうか。
それでしたらそのプライマーを使って部分部分をそれぞれクローニングして、
読んでから切り張りで7kbを作ったほうが楽かもしれません。

エレクトロポレーションでは
セルフライゲーションで作った16kbや、
精製済みのBACやPACの120kb、180kb、210kb
を入れたことがあります。
機械さえあれば（借りられれば）、
コンピテントセルは10%グリセロールで洗っただけで大丈夫です。
普通のグレードのグリセロールでも10^8/ug DNAくらいはすぐに出せます。
キュベットも破裂さえしなければ70%エタノールで洗って乾かせば、再利用できます。

お礼

ライゲーションはInvitrogenのT4Ligaseを使っていますがBufferの中身を見てみたところPEGが入ってました。MIYDさんの言うKitを使わずにということは、BufferもPEGなしで自分で作るということでしょうか？
(すいません、O/Nって何ていう意味ですか？)
いろいろと貴重なアドバイスありがとうございます。

回答No.2

bzxjpjp

もし、taqなどのポリメラーゼでPCRをかけているのでしたら、
TA cloningはどうでしょうか？
PCR後の制限酵素処理を行わなくてもすみますし、簡単だと思います。
あとは、形質転換効率のいいコンピテントセルをつかって、数多くのコロニーを形成させ、力づくでクローニングするのが早いような気がします。
がんばってください。

お礼

アドバイスどうもありがとうございます。TA Cloningはこのぐらい大きくても大丈夫でしょうか？大きいとかなり難しいと聞きますが...どうでしょうか？
形質転換ですが今はInvitrogenのDH5aを使っています。ある人は、合計で10kぐらいになるVectorではCellに入りにくいと聞きました。(その人はElectroporationを進めましたが)ElectroporationとChemical transformationのどちらがいいと思いますか？(今はChemical Tです。)　もしよければまたコメントお願いいたします。

回答No.1

noname#15334

私は8kbのPCR product を3.5kbのvectorに 2 cut ligationしたことがありますので、その時に気付いた事を書きますね。確かに普通のcloningに比べて難しいですが、必ずできますよ！（←この気持ち大事）

原因は色々考えられますが、量が少ないという事がまず妨げになっていると思います。insertの方が長くても、vector より多く入れて下さい。単純計算して2.8kbのvector 10ng(0.005pmol)に対して、7kbのinsert 25ngでモル比1対1になりますので、この5倍から10倍くらいを使えば入るのではないでしょうか？(ちなみに7kbで100pmolは約460マイクログラムになりますから、何かの勘違いでしょう）きれいなspecific ampliconが得られているのであれば、大量にPCRすればよいでしょう。

もう一つ考えられるのは、enzyme cutができているかということです。質問者さんは 1 cutなのか2cutなのか分かりませんが、ポイントを書きます。

vectorのcut後の脱リン酸化処理および酵素失活はできていますか？（特に1cutの場合)

vector側の二つのサイトは隣接していませんか？隣接している場合、一方でしか切れない場合があります。(2cutの場合)

insertになるPCR product は切り出し精製もしくはカラム精製などでprimerを除いてからenzyme cutしていますか？
両端のenzyme site の外側には余裕がありますか？端ギリギリだとenzyme によっては効率が極端に下がります。
2cutの場合、酵素によっては一度に処理すると一方の効率が落ちる事があるので、一つずつ処理した方が確実ではあります。

まず量を多くしてみて、それでもダメであれば一つ一つチェックしてみてはいかがでしょうか？
また、enzyme cutをする時は試薬カタログを参考にされていると思いますが、私はNEBのカタログを愛用しています。

すでに分かっている事も多いかと思いますが、参考になれば幸いです。

お礼

素早いアドバイスどうもありがとうございます！８ｋｂ入れたことがあると聞き、少し安心しました。ほとんど不可能に思えたので...
２Cutです。脱リン酸化処理/失活はコントロールの結果から良く出来ていると思います。
ひとつ思い当たるふしは、サイトの隣接です。8bpしかありません。うすうす思っていたことではあったんですが、やはりひとつのEnzymeがCutした後にもうひとつがCutするのは無理かもしれません...使えるEnzymeがこれらだけだったもので...(xbaI/sbfI) PCRのPrimerには20bpぐらい余裕にあったのですが大丈夫でしょうか？他のVectorも探してみるべきでしょうか？
あと、PCR　Purificationを使ってPurifyしているのですが、極端に濃度が落ちている気がします。