ノーザンブロットが・・・

質問

下垂体前葉細胞を培養して、mRNAを抽出、そのうちの1.5μgほどを泳動してノーザンブロットにかける実験をしています。
その際に成長ホルモンのバンドは出るのですが、normalizeするためのβ-actinのバンドがどうしても出てきません。
プローブのテンプレートがおかしいのかと思い、再度、大腸菌から切り出し、ラベルしてみたのですが、やはりダメでした。実験操作もGHのバンドが出てる以上、間違ってはいないと思っているのですが・・。
ちなみにプレハイ・ハイブリ・洗浄は60℃でやっています。「DNAプローブは42℃でハイブリさせる」と本に書いてあったのですが、やはりそのような温度でやるべきなのでしょうか？（テンプレートは100％muchです）
どなたかこれじゃない？という理由のお心当りのある方、ご回答お願い致します！！

回答No.2

nao0_0nao

質問文を拝見した限り、プローブに問題があるように感じました。
プローブの一部でもシークェンスしてみてはいかがでしょうか？

実験条件に関してはNo.1のsakenomiさんと同じです。

お礼

お礼が遅れまして大変申し訳ございません。
自分はカエルのmRNAをノーザンにかけているのですが、プローブはイモリのものだそうです。しかしホモロジーがかなり高いのでくっつくはずだ、とのことです。
そこで、今は制限酵素で切断し、相同性の高い部分をテンプレートとして使用してみようとしています。
ご回答ありがとうございました。

回答No.1

noname#4684

1.　洗浄をゆるくする（SSCの濃度を上げる/温度を下げる）
2.　ハイブリ温度を下げる

あと、まさかとは思いますが、その大腸菌は本当にβ-actinでしょうか？インサートのサイズやシーケンシングなど、簡単にでも調べれればいいんですが。ＧＨでノザンが正常に回っていらっしゃるようなので、そのようなまさかというような凡ミスの可能性もありうるかと思いました。

お礼

ご回答ありがとうございます。
テンプレートは切り出したときにマーカーを一緒に流してサイズを確認してから使用しましたので、間違ってはいないと思われます。
今日、totalRNAの量を増やして泳動し、膜に転写してきました。ハイブリ・洗浄はご指摘の点に注意しながら行ってみようと思います。
ほんと、バンドが出てくれ！！と祈る毎日です（笑）