植物RNAを用いた非RIノーザン

質問

トマト葉からtotalRNAを抽出して遺伝子の発現をノーザン解析しています。
DIG標識したプローブを用いてケミルミで検出しようと試みていますが、全然うまくいきません。
バンドが何も出てきません。
感光時間を長くしたら、バックグランドが黒くなり過ぎてしまうのであまり解決にならないし・・・。
１レーン当たり10マイクログラム流していますが、それでも少ないのでしょうか？

これだけの情報ではアドバイスにも困られるかと思いますが、何かノーザンで重要なポイントがありましたら教えて下さい。お願いします！

回答No.1

noname#4968 · ベストアンサー

ステップが多い実験系のために，不具合が起きると原因究明にも時間がかかりますよね．

レーンあたりのRNA量は論文等を参考にすればよろしいと思います．私の周りでは20マイクロが多いみたいですが，10マイクロだからと言ってバンドが出ないと言うことはないと思います．（メンブレンにトランスファーした時に問題はなかったでしょうか？）
サイズマーカーも出ないのでしょうか？
どのサンプルでもバンドが得られるようなプローブを使ってみましたか？（検討済みでしたらごめんなさい）一度ハイブリダイズしたプローブを剥がすのも，
DNAメンブレンとは異なりますから，気を付けてください．

ロシュから『DIGシステムを用いてハイブリを行う為のユーザーガイド』というのが，無料でもらえます．（たぶんネットからでも．業者さんからでも）これが結構使えるので，参考にするとよろしいかと思います．
実験コストが高いので，十分検討してみてください．
あまりズバリな回答でなくてすみません．

お礼

回答ありがとうございます。
１０でも結構少ないんですね。次回は２０に増やしてみます。
ロシュのＨＰにも行ってみようと思います。

回答No.2

noname#4684

DIGでノーザンって難しいですよ．実験者にテクニックの不足がなくても，シグナルは，出ないことが多いです．

脱アイソトープ実験プロトコル（羊土社・野村慎太郎著）を参考にしてください．たしかDIGキットの説明書にも書いてあると思いますが，プローブはアンチセンス鎖のin vitro転写プローブを使っていますか？　ランダムプライムド法だと無理かもしれないです．

わたしもDIG ノーザンしていました．アンチセンスRNAプローブを使ったときにたった一度だけシグナルを出せました．が，あきらめてアイソトープ標識に移行しましたよ．

RNA量は10μgでいいと思います．が，論文で一番よく目にするのは20μgです．１レーンにアプライする量は検出したい転写産物がどれだけリッチかによりますね．

お礼

もともとはＲＩを考えてのプローブなのでＤＩＧには無理があるのかもしれません。
脱RI実験の本を教授が持っていましたので、勉強しなおして頑張りたいと思います。
ありがとうございました。