電気泳動に時間がかかる

質問

ウエスタンブロッティングを始めたのですが、電気泳動がうまくいかなくて困っています。
20mAの定電流で行っているのですが、電圧は16V程度しか上がらず、数時間経っても泳動しません。電流を200mAくらいまで上げていくと少しずつ流れますが、それでも5~6時間かかります。ゲルを染色するした結果、一応サンプルが流れていることは確認できました。
以前は20mAを1時間＋40mAを1時間の2時間で終了できていたのですが、最近になってうまく泳動ができなくなりました。原因は何なのでしょうか？

ゲルの組成としましては
モノマーストック溶液（Aclylamide PAGEとN,N-Methyllene-bisacrymideをDWで溶解）、４×分離バッファー（1.5M　Tris-HCl,pH8.8)、４×濃縮バッファー（0.5M　Tris-HCl,pH6.8）、10%SDS、DW、18%APS、TEMED　をアクリルアミド濃度10%になるよう調製しています。
また、サンプルは筋のホモジネートを検体処理液と等量混ぜて、4～5分boilしています。
周りに分かる人がいなくて独りで試行錯誤しているのですが、何が原因だか分からず困っています。よろしくお願いします。

回答No.1

Hayate03 · ベストアンサー

泳動バッファーの濃度が間違っていませんか？ゲルバッファーかも知れません。
組成を確認して、再調製してみてはどうでしょう。

濃度が濃いと電流が多く流れるため、電圧がかからなく（かけられなく）なります。
あとは、リークか電源装置の不調の場合があるかも知れませんね。
（リークは、ゲル以外の部分に電流が流れている状態のこと）

補足

ご回答ありがとうございます。
泳動バッファーは、Tris 3 g、グリシン 14.4 g、SDS 1 g、DW 1000mlを使っています。私もバッファーが怪しいと思い、注意しながら作り直しましたが同様な結果でした。
電源装置とリークについては考えていませんでした。確認してみます。

回答No.6

geneticist12

可能性は高くないかもしれませんが念のため、

モノマーストック溶液がひどく劣化しているというようなことはないですか。
分解してアクリル酸を生じ、pHを下げ、イオン濃度を上昇させます（どちらも書かれているような現象の原因になり得ます）。
ストック溶液pHペーパーではかってみて酸性になっていたら、作り直すか、イオン交換樹脂で処理してやってみてはどうでしょう。

お礼

原因が分かりました！
ゲル板をバッファーに浸け込むタイプの泳動槽を使っているのですが、ガラス板を1セットしか使っていなかったのが原因でした。
電流が後ろから流れてしまい、うまくゲルに流れていなかったようです。2セットつけて泳動すると、うまく流れました。
初歩的なミスですみませんでした。ありがとうございました。

回答No.5

otx

私にはわかりません。
文面を見ているだけでは何が悪いかわかりません。

参考までに、私は同じバッファー組成で泳動していますが、
30ｍAの定電流で、110～120Vになります。

一度、ご自分のプロトコールではなく、ATTOなどので紹介されている確かなプロトコールでやってみてはいかがでしょうか？

補足

私も以前は、10mAで60V、20mAで190V程度になっていました。
試薬や溶液の劣化が原因なのでしょうか。。
今一度、ATTO等のマニュアルを読んで間違いがないか確認してみます。

回答No.4

geneticist12

あわわ、誤解させてすみません。

＞ご指摘の通り、原因はゲルの組成の間違いのような気がします。ゲルバッファー調製後pHが大きくずれていたため、HClで調整していました。

先にわたしが指摘したのは泳動用のTris-Gycineバッファーのことです。
ゲル作成用のTris-HClバッファーはもちろんHClでpHしていいです。

＞泳動バッファーは、Tris 3 g、グリシン 14.4 g、SDS 1 g、DW 1000mlを使っています

組成はあっているようです。
溶かすだけで通常pH 8.3（濃縮ゲル/サンプルバッファーと分離ゲルの中間）になるはずで、pH調整を行う必要はありませんが（むしろやってはいけません）、pHのチェックだけはして、大きくずれている場合は、はかり間違い、試薬の間違いや品質の問題があるので作り直すべきだということです。

よくあるのが、Tris base（普通のTris）とTris-HCl塩の取り違い、低グレードの試薬を使った（不純物が多いとか。SDSはメーカーやグレードによってずいぶん酸性のことがあある）など。

補足

今日も電気泳動をしていますが、やはり電圧は16～17Vのままでうまく流れません。
泳動バッファーのpHは8.55でした。気をつけて作りましたので、はかり間違いはないと思います。ちなみに、前回作ったバッファーのpHもそれくらいだったと思います。
そうしますと、ご指摘のとおり、試薬の品質の問題なのでしょうか？

回答No.3

otx

電気泳動以前に、電流と電圧の関係から考えてみます。

定電流に設定した場合、その電流が流れるために必要な電圧しかかかりません。１６Vしか上がらなくても、電流が20mA流れているのなら、泳動はできるはずです。

逆に、そんな低い電圧で20mAが流れているのは、バッファーがものすごく電流を流しやすいと私は思います。

200mA流した時には電圧はどの程度でしたか？

あと、ｐHですが、キレイなタンパク質の泳動には重要ですが、
電荷を帯びた物質であるのならば、泳動はされる（移動はする）はずです。サンプルバッファーには青色ついていますよね？
その色素はちゃんと動いていますか？

以上のことを教えていただくと、もっと状況がわかります。

個人的には、電源装置は大丈夫？って思います。

補足

ご回答ありがとうございます。
200mAで流すと電圧は100V前後でした。
また、サンプルは2-MEやBPB等で処理しています。電流を流すと薄く広がり、そのまま時間をかけてゆっくりと動いていきます。
電源装置は3つあるのですが、どれを使っても同じ結果でした。

回答No.2

geneticist12

電気泳動バッファーが一番あやしそうですが、自作ですか市販品ですか。
自作だったら、組成や試薬、作り方をしっかり再確認してもう一度確認して作り直し、市販品なら新しいのに変えてみては。

間違いやすそうなのは、ふつうのTrisとTis-HCl塩の取り違い、pHをHClやNaOHで調整してしまうなど（正しく作っていればpHは合っているはず。逆に、全部の試薬を溶かしきった時点でpHが大きくはずれていたら何か間違っている）どちらの場合も、塩濃度が高くなって、おっしゃるような現象が起こる可能性があります。

補足

ご回答ありがとうございます。
泳動バッファーについては、何回か作り直してみましたが同じ結果でした。
ご指摘の通り、原因はゲルの組成の間違いのような気がします。ゲルバッファー調製後pHが大きくずれていたため、HClで調整していました。もう一度作り直してトライしてみます。