2D PAGE

質問

初心者です。あるリコンビナントタンパク（2mg/μl)をバイオラッド社の機器で等電点電気泳動しました。一次元目は、ph7付近に出ました。そこから続けて2次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥをしましたが、20Ｋｄａあたりになるはずが、結果は50-70Kdaのところに、バンドが濃く出ました。原因はわかりませんが、類推されることがあれば、お教えください。
試薬
膨潤バッファ：　7M Urea 420mg/ml
2M チオUrea 152mg/ml
4%　CHAPS 40mg/ml（界面活性剤）
1M DTT 20μl/ml
0.1% BPBブロモフェノールブルー　　20μl/ml

ＳＤＳ平衡化バッファ：
　　　　　　　　1.5M Tris Hcl buffer　pH　8.8　　　　　　　6.7ml
　　Urea 72.07g
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　グリセロール　　　　69ml
ＳＤＳ 　　 4.0g
BPB(0.1%)　　　　　4ml

10×泳動バッファ　　1L 4℃で保存
Tris 　　　　30.3g
グリシン　　　144.0g
SDS 10.0g

泳動
サンプルが固形のときは、膨潤バッファで溶かす
液体のときは、　膨潤バッファ：サンプル＝９：１（もしくは　４：

還元・アルキル化
還元用　　　　ＳＤＳ平衡化バッファ　＋ＤＴＴ（冷）　50mg/5ml　（よく溶かすこと）
　アルキル化用　ＳＤＳ平衡化バッファ　＋ヨードアセトアミド（冷） 125mg/5ml

トレイに還元用を3ml入れ、ストリップゲルを入れ（ゲルが上側）、30min shaker

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　分離ゲル：　　　MilliQ 3.4ml(15%なら2.4ml)
30mlアクリルアミドビス（毒）　　　 　 4.0ml(15%なら5ml) ゲルバッファー（1.5M Tris Hcl buffer　pH8.8）　 2.5ml
10%　ＳＤＳ　（過硫酸アンモニウム）　　　　　　　　　　0.1ml　10%　ＡＰＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　50μｌ
ＴＥＭＥＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5μｌ

回答No.3

teru-arai

#2です。
訳の訳のわからないことが起きたら、とにかく確かめられる所を一つ一つ確かめていくのは基本だと思います。ご自分で電気泳動されてバンドがどこにでるか確認した方が良いと思います。できる限り2次元の時と同じように調製したサンプルと、くれた相手が行っている電気泳動と同じように調製したもの2通り有った方が良いと思います。とにかく、いろいろ起こりえますから。例えば、間違えて別のサンプルをくれたのかもしれないし、もらったのと別のサンプルを電気泳動しているのかもしれないし、どちらかが分子量マーカーの読みを間違えているのかもしれないし・・。

上記が正常とすると、バンドの位置がずれる原因ははっきりとはわかりかねますが、以下推察です。
１）タンパク質に結合したSDSは離れにくいのですが、昔タンパク質からSDSをはがすために、6Mぐらいの（濃度はあまり覚えてません）ウレア＋TritonXを用いていた記憶があります。従って、ウレアがあるとSDSはタンパク質に結合しにくくなると思います。
昔私は、等電点泳動が終了したゲルをSDSのサンプル用緩衝液（pH6.8のトリス、SDS、グリセロール（これは無くとも良い）、メルカプトエタノール、BPB）に浸してから2次元目のゲルにのせてました。質問者さんのSDS泳動への平衡化バッファーにはウレアが入ってますけど（あと、トリスのpHが8.8ですがこれは書き間違いかな）、これも奨励されている方法なのですか？　一度ここのウレアを抜いたもので平衡化してみられたらどうでしょう。
２）昔はウレアだけで組織を溶かしてましたが、最近はチオウレアも入れるんですね。私はまだチオウレアを使ったことがないのですが、チオウレアが2次元目、SDSの電気泳動に影響を与えるなら当然使われていませんよね。ずっと使われて続けているのなら、SDSの電気泳動に影響を与える可能性は低いんじゃないでしょうか。
チオウレアについて私は情報を持っていませんが、書かれている内容から推察しますと、どこかのメーカーのキットを使われているように見受けられます。そのキットにチオウレアの使用が書いてあるならそのメーカーに情報収集を依頼したらどうでしょうか。
昔、私が学生だった頃、2次元電気泳動は大はやりで（この頃の生化学の論文を見るとほとんどのに2次元電気泳動の図が出てます）、私も当然のようにやりました。最近、またやり始めることになってますので、質問者さんのトラブルも全くの人ごとでもありません。たいした力になれなくてすみませんが、うまくいくことを祈ってます。

お礼

遅くなり、すみません。
丁寧な回答を有難うございました。
もっとよく調べるべきだったのですが、初めてでわけが分かっていませんでした。
とても参考になります。重ね重ね御礼申し上げます。

回答No.2

teru-arai

おっしゃっていることがよくわかりません。
＞20kDa あたりになるはずが、50-70Kdaのところに、バンドが濃く出ました

2次元をしないでいきなりSDS PAGEだけをすると20kDa あたりにバンドがでて、それが2次元をすると50-70Kdaになるとるということですか？
　それとも、“20kDa あたりになるはず“というのは確かめられていない単なる仮説ですか？

お礼

2次元をしたときに、バンドの位置が50－75Kda付近だったのです。
20Ｋda　というのは、確かめられているものです。リコンビナントタンパクを調整している方から頂いたものです。

チオＵＲＥＡの尿素が結合して、タンパクにＳＤＳがくっつかず、結果的に電気泳動ができなくて（流れにくくなり）、みかけ上その位置にいるのかもしれない、とも考えています。

回答No.1

air_jp

ケラチンでは？