連結反応（ライゲーション）について

質問

制限酵素処理に比べて、
なんか連結反応（ライゲーション）って難しくありませんか？

どうなんでしょう。ただ単にそのような酵素処理系ってだけなんでしょうか？

それとも、やっぱり単に僕の腕が悪い＆勉強不足だけなのでしょうか。

気になります。

回答No.1

noname#53364 · ベストアンサー

それはライゲーションの方がステップが多いからですよ。
ベクターの調製、フラグメント処理、AP処理、回収さらにライゲーション時のベクターのフラグメントの比と少し考えただけで、かなり多いですよね。
また断面によっては入りにくいものもありますから。逆方向にしかはいらないとか。

制限酵素で切る場合でもダブルダイジェスチョンになると切れにくい場合もありますよね。酵素の種類によってもやはり切れにくい場合もありますし。

ライゲーションもベクターを一個所で切って回収、セルフライゲーションするだけなら効率はとてもよいですよ。（意味ないですけど）

「習うより慣れろ」というような系ではありますので頑張って上手くなりましょう。日本ジーンのカタログにも試行錯誤せよというようなことも書いてあります。アドバイスとしては制限酵素でしっかり切る。ライゲーションし易い断面を使う（EcoR1,BamH1,Hind3など）、回収時にUVをあてすぎない。AP処理をしすぎて断面をつぶさない。ライゲーションキットの中のATPは実は壊れ易い。など月並みですが基本を守ると上手くいくと思いますよ。

お礼

やっぱりライゲーション自体がある程度の難度を持っているのですね。

回収時にＵＶを当てすぎない＆ＡＰ処理をし過ぎない、というのは
参考になりました。
もっと気を付けてみます。

この系に『慣れる』ためにがんばってみます！

akiyamaharukaさん、ありがとうございました。

回答No.2

knightgold

akiyamaharukaさんの言われるように、ステップが多いので、どこで上手くいってないかを特定するのが難しいですよね。

　下の方の補足みたいな感じですけど、昔、余り使わないような酵素で切断していたのですが、やっぱりつながり難かった感じはありますね。それぞれのDNAの長さも関係あるのではないでしょうか？（これは推定）。

　昔自分が失敗していたり人が失敗していた内容を聞くと、あまりありえない事ですが、酵素の失活がうまく行ってなかった事。次に、DNAの回収が上手く行っていない場合（これは自分が経験した）で、例えばキットで回収を行っているのだけれども、あとで確認したら実は回収できてなかった（操作的問題で側鎖の長さによって使う試薬や量を間違えていたり）場合です。

他にはゲルの切り出しが上手くいってない場合か、違う場所を切っているのか、UV当てたときにいくつものバンドもしくはスメア（バンドが流れて出てる時）が出ていておかしいときとか（みたら何じゃコらーって感じ）。

　他には単純に、違うDNAもしくは物質ががコンタミしている場合もあるかも。最初の切る目的のDNAが良くなかったら、もしくは濃度が高かったり、少なかったりしたら良くないですよね。

　自分の克服方法は、各操作段階（切り出し、回収後等）でDNAを流し目的のDNAがあるかを確認してやってましたね。akiyamaharukaさんが言うようにUVに当てすぎは宜しくありませんので、あくまでもこれは予備的実験で、どこがおかしいのかやってましたね。かなり備品、酵素を使用するので、余裕が有るときは良いかも？
（もしかして卒論?修論？だったら時間ないね（T_T））

　もう一度、自分の操作法が間違っていないかを確認したらどうでしょうか？
　（いやーほんとに色々なステップがあるから間違えていることもあるよ）
　余裕があって、かならずそのライゲーションしたものを取得したいのでしたら、
　上の方法で、実験方法を確認するのも手だと思います。

　以上です。

お礼

そうですね。
一回そのようにしてステップごとに確認してみた方がいいですね。

確かに大変そうですがやってみる価値はありますよね。

knightgoldさん、ありがとうございました。