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電気泳動でウェルに白い沈殿が
アルカリ法で精製したDNAを泳動したのですが、まずウェルの部分に白い線が残り、次にウェルのすぐ下にバンドがひとつ、さらに下に濃度のマーカーと同じ位置にバンドがもうひとつ、と3つに分かれてしまいます。 目的のバンドはマーカーと同じ位置の、一番下のバンドだと思うのですが、ではその上のバンドとウェルの沈殿は何なのでしょうか。 DNA量が多いのかとも思い、1μlでも流してみたのですが、やはりウェルに白く残るものがあります。 ちなみにEcoで切ってもみたのですが、やはりウェルに白く残っていました。 これはDNAではないのでしょうか？何なのでしょうか？
- kurogomasan
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- 生物学
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まあまあというかんじですが。 質問された方も微妙な空気でお困りと思いますが、mini-prepは基本中の基本とされているだけに、みなさん「ふつうは」といっておりますが、細かいところではみなさんいろいろ違うと思いますので、勇気があれば（笑）ご自身のprotocolを書かれれて、みなさんの普通のやりかたというのをいろいろ聞いてみるのがいいですし、おすすめは一般的なprotocol集を購入するなりwebで調べるなりして見比べてみて違うところを質問されるとはっきりするかと思います。 白い沈殿物が何かということですが、どなたかがおっしゃるように、泳動中に起こることであればDNAサイズマーカーのところも白くなりますか？または何も泳動していないウェルも沈殿がありますか？ エチブロがTAE bufferまたはTBE buffer下で析出？する条件では私はやりませんので、実際に何が沈殿しているかはわかりかねますが、sampleへのコンタミと泳動の問題は分ける必要がありますね。 googoleでmini-prepで引くといっぱいprotocolが出てきますので、参考までにしたのサイトはわりと「ふつう」のprotocolかと思います。
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- Euxine
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QIAGENのプロトコルに、プラスミド精製の泳動パターンが出ています。まず、下のリンクからPDFのP27を見てみてください。どのレーンのバンドパターンに似ていますか？EcoRIで切断したものもありますので、パターンとお困りの症状を比べてみてください。すぐ解決すると思います。泳動後、その白いものがウェルの位置から移動しているのかいないのかも、重要な点だと思います。
お礼
ありがとうございます。 参考にさせていただきます。
- atyushi
- ベストアンサー率50% (5/10)
＞ふつうに精製すれば白くならない 何も流さなくてもウェルは白くなるものです。 別の理由としてウェルが白くなるのはエチブロが溝にはまっているから が考えられます（ウェルの壁側が主に白くなっていませんか？同様にゲルの周りも白くなっていませんか？） 染色したゲルをWashするとウェルは白くならなくなります。 アルカリプレップごときで真空乾燥はふつうしないと思いますが。
お礼
幾度もご回答いただき、ありがとうございます。 まず、ゲノムDNAのコンタミの可能性ですが、初めに私もそれを疑ったため、Sol2の時間を短くしてみました（長いとコンタミの可能性が高くなると聞いたので・・・）。 しかし、やはりウェルに白いものがでてしまいました。 DNAが溶解していないのかとも思いましたが、一晩置いてから流してみてもウェルは白くなってしまいました。 エチブロ残留の可能性については、ゲルは染色後蒸留水でWashしていますし、マーカーのウェルは白くならないため、この可能性はないと思います。
- Euxine
- ベストアンサー率58% (7/12)
アルカリ変性の際にボルテックスをかけたり激しく混合したりしていませんか？ゲノムDNAがどうしても混入するなら、カラムを使うか（手っ取り早い）、カラムがないならタンパク質とゲノムのペレットを沈殿して除く際に遠心→回収の回数を増やし、極力底部にピペットを近づけないようにする事でだいぶ改善されると思います（勿論完全には取れませんが）。それから遠心の際のRPMはMAXですか？制限酵素でゲノムが切れないのは、精製度の悪いDNAを使うと割とあることです。ゲノムが絡まって、立体構造的に酵素がDNAに近づき辛くなります。 ゲノムDNAを制限酵素で処理して使うのは、以後の実験を考えますとあまりよい方法ではないかと。改善するといいですね！
お礼
アルカリ変性はボルテックスはかけていませんし、遠心もMAXでやっています。 また、泳動でウェルに白いのがでたサンプルをキアゲンカラムに通し、Ecoで切ってからもう一度泳動してみたのですが、やはりウェルに白いものが・・・（涙 カラムを通してもでるということは、タンパクやゲノムDNAというよりは、溶解していないDNAと考えるほうが妥当なのでしょうか？ しかし、精製度の悪いDNAを使うと酵素で切れないこともあるのですね。勉強になりました。 ちなみに、この白いのはソニケーションかけても出ます。 かなりしぶといのです・・・（涙
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
＞フェノクロ2回、エタ沈2回やってもウェルは白くなるものです。 それはそれで、問題があると思いますよ。ふつうに精製すればウェルに異物が残ることもなければ、ゲノムDNAがそんなに大量にコンタミしてくることもないですから。精製した真核生物のゲノムDNAを未消化で泳動してもウェルに残ることはないですし。 ただ、言われて思いついたのは、エタノール沈殿後のDNAを乾燥させすぎたのが原因かもしれないと。たとえば、真空乾燥したりしていませんか？ 最近では、真空乾燥は再溶解を困難にしたり（結果、溶解していないDNAがアグリゲーションを起こす）、DNAを変性させたりするので、自然乾燥すべきである、ということになっています。
お礼
乾燥は、65℃の乾燥機に入れています。 しかし、エタノールの匂いがしなくなったら水分が飛び切っていなくても出してしまうので、乾燥し過ぎていることはないと思うのですが・・・ でも、自然乾燥のほうがよいのでしょうか？
- atyushi
- ベストアンサー率50% (5/10)
みなさん本当に専門家なのでしょうか…？ フェノクロ2回、エタ沈2回やってもウェルは白くなるものです。 （A260/A280が＞1.80でも） よって、ウェルに残るものはタンパク・SDSによるものとは考えにくいはずです。 ノザンブロッティングの際のゲルのウェルは白く写っていないことから、ゲノムDNA（おそらく凝集して巨大分子となった）もしくは溶解していない（固体）DNAと考えるのが妥当ではないでしょうか？
- Dr_Hyper
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あまりアルカリプレップでご質問のような経験がありませんが、SDSの持ち込み、ゲノムDNA、タンパク質（主に不溶性のデブリ）のどれかでは無いかと思われます。フェノール/クロロホルム処理を行うか、エタノール沈殿を再度行うか、DNA精製用のカラムの通してみるかだと思います。試薬の調整、とくにpHの異常ではアルカリバンドといって余分な変成してしまったplasmidがとれることがありますし、大腸菌が弱っていると、plasmid dimerといってちょうどplasmid２分子分が複製の際にうまく切り離せなくてできてしまうこともあります。 作り置きのアガロースゲルは一度ウェルを洗ってみるとTAEから生じる沈殿はなくなります。 思いつくままに書いてしまい、まったくまとまりの無い文章ですみませんが、不明な点あれば再度御答えできると思います。
- atyushi
- ベストアンサー率50% (5/10)
ウェルに残るのは溶解しきれなかったDNAと聞きます。 アルカリSDS法は、大腸菌膜とゲノムDNAの複合体を引っ掛けて落とすのですべてのゲノムDNAを除去できるものではないと思います。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
白いのはタンパク質のコンタミでしょう。 ボイル法などでとった精製度の低いプラスミドではしばしばお目にかかります。 塩析の後、上清をとるときに白い沈殿を吸ったりしていませんか。 慎重にやって、沈殿を取らないようにすれば、塩析だけでもかなりきれいにタンパク質を除けますが、まだ残っているようなら、フェノール抽出をしたら良いでしょう。
お礼
ご回答ありがとうございます。 目で見る限りでは、沈殿は吸っていないと思うのですが・・・ 精製後TEに溶解した後も、沈殿の類は見えません。 泳動するとウェルに白い線として現れるのですが、タンパク質はそんなに綺麗な線状に流れるのでしょうか？ あと、エチブロで染色されるのですか？
- Euxine
- ベストアンサー率58% (7/12)
状況がよく分かりませんが、もし大腸菌で精製したプラスミドなら ウェル→大腸菌ゲノムＤＮＡ ウェルのすぐ下→スーパーコイル状ＤＮＡ 一番下→目的プラスミド そのまま実験に使っても問題ありませんが、次からカラムを使うとよいでしょう。
お礼
説明が不足していて申し訳ありません。 大腸菌で精製しています。 ゲノムDNA混入の疑いもあったため、SDSを加えた後の時間をみじかくしたのですが、やはりウェルに白いのが出てしまいました。 ゲノムDNAはどうしても混入してしまうものなのでしょうか？ あと、ゲノムDNAはEcoでも切れないのでしょうか？
お礼
大変親身なご回答、ありがとうございます。 まとめての御礼になってしまうのですが、たくさんの方にアドバイスを頂いて、本当にありがたいです。 ご指摘いただいた点につきまして、SDSの持ち込み、というところが気になりました。 SDSが多すぎると泳動の際にウェルに白くでるような析出の仕方をするのでしょうか？ また、参考URLに頂きましたプロトコルで、Sol2のNaOHはできれば使用直前に入れる、とありますね。 確か1カ月は前に作った古いものを使っていたような・・・これがいけなかったのかもしれませんね！ 作り直してみます。 ＞試薬の調整、とくにpHの異常ではアルカリバンドといって余分な変成してしまったplasmidがとれることがありますし、大腸菌が弱っていると、plasmid dimerといってちょうどplasmid２分子分が複製の際にうまく切り離せなくてできてしまうこともあります。 変性したプラスミドやプラスミドダイマーというのは、どの様な流れ方をするのでしょうか？ （無知ですみません・・・） ここにまとめてご指摘の点を書き出します。 サンプルについて ・長期冷凍保存してあった大腸菌を、種培養してから大量培養しました 精製法について ・SDSは1ヶ月ほど前に作った物で、撹拌にはボルテックスは使っておらず、撹拌時間は5分以内 ・遠心はMAXで、沈殿は吸っていません ・乾燥は65℃で10分ほど。完全には乾いていません 泳動について ・マーカーのウェルは白くなりません。白い沈殿がでるのはサンプルのウェルだけです ・エチブロ染色後はWashしています。 ・ゲルは新しい物を使っています。 精製後のサンプルについて ・Ecoで切っても泳動の際ウェルに白いのが残ります ・ソニケーションしても切れずにウェルに白く出ます まとめて書いてみましたが、だんだんSol2の作りおきと、Sol3で撹拌のしすぎでタンパクやゲノムDNA（両方？）がコンタミしているのではないかと思えてきました・・・。 もう一度これらに注意して実験してみようかと思います。